elocation-id: e4251
Cuando los tejidos de tallo de Agave angustifolia se establecen in vitro ocurre frecuentemente contaminación microbiana, por lo que se evaluó el uso de antibióticos para resolver este problema. El objetivo de este trabajo fue determinar el porcentaje de tejidos de tallo que se establecen asépticos y con respuesta morfogenética en tres situaciones: 1) durante el establecimiento in vitro (etapa I); 2) en explantes que en la etapa I ocurrió organogénesis con formación de brotes, pero estaban contaminados con bacterias, y éstos se trataron con antibióticos para eliminar contaminación; y 3) en brotes adventicios asépticos obtenidos en etapa I y transferidos al medio de multiplicación de propágulos (etapa II). Se evaluaron los porcentajes de cultivos asépticos, tejidos viables y respuesta organogénica. Los resultados mostraron que solo entre 3.68 y 8.73% de los tejidos de tallo se lograron asépticos durante la etapa I. Pero, al aplicar antibióticos a brotes ya formados pero contaminados por bacterias en esta etapa, se recuperó la asepsia en 52.5% de los cultivos. Por otro lado, los brotes adventicios que fueron asépticos desde la etapa I y se trasladaron al medio de multiplicación (etapa II) mantuvieron la asepsia en un 89.88%, todos fueron viables y mostraron formación de nuevos brotes. Estos resultados indican que el tratamiento con antibióticos en tejidos de tallo ya inducidos es una estrategia efectiva para rescatar cultivos contaminados y que la transferencia de brotes asépticos a la etapa de multiplicación permite mantener cultivos asépticos con respuesta morfogenética.
antibióticos, contaminación microbiana, microorganismos, organogénesis
El género Agave de la familia Asparagaceae incluye numerosas especies adaptadas a condiciones áridas. Estas especies son importantes económica y culturalmente, ya que de ellas se obtienen azúcares, fibras, bebidas alcohólicas y otros productos (Domínguez-Rosales, 2008). En México, según el Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera (SIAP, 2019), los cultivos de agave se cultivan en 120 000 ha, distribuidas en 363 municipios de 15 entidades federativas, de las cuales el 14.6% se destina a la producción de mezcal. Las entidades con mayor superficie de agaves mezcaleros son Oaxaca (55.4%), Guanajuato (14.9%) y Guerrero (8.7%).
En 2024, Oaxaca reportó 11 774.9 ha cultivadas con agaves (DGSIAP, 2024), de las cuales el 80% corresponde a A. angustifolia Haw. conocido comúnmente como ‘espadín’ (Jarquín-Rosales et al., 2022), siendo esta especie la principal materia prima para elaborar mezcal. La reproducción sexual de esta especie es poco y se recurre a la propagación asexual, principalmente mediante hijuelos de rizoma (Domínguez-Rosales, 2008).
El cultivo de tejidos vegetales (CTV) ofrece una alternativa de propagación asexual eficiente, que permite obtener plantas vigorosas, sanas, genéticamente uniformes y rejuvenecidas en corto tiempo (Fortes y Pais, 2000; Zeng et al., 2007). En agaves, la micropropagación se basa en la activación de meristemos axilares o en la morfogénesis adventicia y de novo (Robert et al., 1992; Enríquez-del Valle, 2008; Millán-Soto et al., 2016; Sánchez et al., 2020). El protocolo general consta de cinco etapas (George y Debergh, 2008; Enríquez-del Valle, 2008; Ríos-Ramírez et al., 2018): 0) selección de plantas sobresalientes y su preparación en vivero (sanidad y condición fisiológica óptima); 1) establecimiento aséptico del explanto; 2) multiplicación de propágulos; 3) enraizamiento de brotes; y 4) aclimatación de plantas micropropagadas en invernadero.
Se ha reportado la propagación in vitro de varias especies de Agave, incluyendo A. tequilana (Morales et al., 2015), A. fourcroydes (Abreu et al., 2016) y A. angustifolia (Miguel-Luna et al., 2013; Ríos-Ramírez et al., 2018). En CTV se presentan situaciones a resolver: Alta contaminación microbiana (hongos y bacterias endófitas latentes) que puede causar pérdidas del 30 al 70% de los cultivos (Enjalric et al., 1988; Leifert y Waites, 1992; Leifert y Cassells, 2001), oxidación fenólica de los tejidos cortados (Azofeifa, 2009), respuesta diferencial según genotipo, tipo y edad del explante, y condición fisiológica, presencia de bacterias endófitas asintomáticas (Pérez-Pazos et al., 2023). Los medios de cultivo ricos en nutrientes favorecen el crecimiento de microorganismos contaminantes (Altan et al., 2010).
Con el fin de optimizar el protocolo de micropropagación, en el presente trabajo se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1) evaluar la cantidad de explantes de tallo que logran establecerse de manera aséptica y con respuesta morfogenética en la etapa I (establecimiento); 2) determinar la eficiencia del uso de antibióticos para erradicar microorganismos en explantes contaminados durante la etapa I; y 3) cuantificar la proporción de cultivos de brotes que mantienen su asepsia al ser transferidos de la etapa I a la etapa II (multiplicación). De esta manera, se buscó contribuir al desarrollo de un protocolo robusto y reproducible que permitió la producción masiva de plantas seleccionadas, sanas para el establecimiento de plantaciones comerciales de agave mezcalero de alta productividad y calidad.
Lugar de trabajo y material vegetal. La investigación se realizó en el vivero y el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales del Instituto Tecnológico del Valle de Oaxaca, en Santa Cruz Xoxocotlán, Oaxaca, México. Se utilizaron tres tipos de material vegetal: 1) de plantas en vivero se obtuvieron tejidos de tallo para establecerlos asépticos in vitro; 2) brotes adventicios en cultivos in vitro contaminados; y 3) brotes adventicios en cultivos asépticos in vitro.
Tratamientos 1 y 2. Plantas micropropagadas de Agave angustifolia Haw. de 2-5 años, creciendo en vivero, estuvieron durante seis meses en macetas de 5 dm3 con sustrato de arena, fertirrigadas cada cuatro días con solución Steiner (50%) y asperjadas dos veces/semana con Benomilo® y Oxitetraciclina®. Los tallos se extrajeron, se eliminaron hojas y raíces y se desinfectaron en laboratorio según: tratamiento 1 (tallos de plantas de 2 años): lavado con solución detergente 0.1% (15 min), champú 0.2% v/v (5 min), Oxitetraciclina® 0.1% (20 min), hipoclorito de sodio 0.6% (15 min), 3-5 enjuagues con agua esterilizada. Tratamiento 2 (tallos de plantas de cuatro años): lavado con solución detergente 0.1% (15 min), champú 0.2% v/v (5 min), hipoclorito de sodio 0.6% (15 min), cindo enjuagues con agua esterilizada.
En condiciones de la cámara de aire filtrado de flujo laminar horizontal, el uso de herramientas de disección esterilizadas, los tallos se cortaron en secciones de 1.5 × 1.5 × 0.3 cm y se cultivaron en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) complementado con: vitaminas (piridoxina, tiamina, ácido nicotínico 0.2 mg L-1 cada una), sacarosa 25 g L-1, inositol 0.1 g L-1, ácidos ascórbico y cítrico 0.05 g L-1 cada uno, BAP 1 mg L-1, AIA 0.15 mg L-1. El pH se ajustó a 5.8 antes de agregar agar 6 g L-1. Se distribuyeron 20 ml a cada frasco de 145 cm3, se colocó la tapa de polipropileno y se esterilizaron en autoclave durante 15 min a 120 °C y 1.2 kg cm-2. Los tallos se cortaron asépticamente en secciones de 1.5 × 1.5 × 0.3 cm y se establecieron en el medio de cultivo. Se colocó la tapa y selló con polietileno adherente, para incubarlos durante 10 semanas expuestos a iluminación LED (35 µmol m-2 s-1), fotoperiodo 16/8 h luz/oscuridad y temperatura 15-29 °C.
Subcultivo de brotes adventicios asépticos (tratamiento 3). Racimos de 3-5 brotes adventicios asépticos obtenidos por organogénesis se separaron en grupos de 2-3 brotes y se subcultivaron en el medio de cultivo similar, para inducir el desarrollo de brotes, bajo similares condiciones de incubación.
Recuperación de brotes de cultivos contaminados (tratamiento 4). Brotes adventicios contaminados por bacterias se extrajeron del cultivo in vitro y desinfectaron con etanol 70% (15 s), se secaron con papel esterilizado y se establecieron en medio MS gelificado que contenía cloranfenicol 100 mg L-1 y ampicilina 100 mg L-1. Se incubaron en las mismas condiciones que los demás tratamientos (Ríos-Ramírez et al., 2018).
El experimento se estableció según un diseño completamente al azar. Se establecieron 724 cultivos in vitro, distribuidos así: T1, 190 cultivos; T2, 159 cultivos; T3, 336 cultivos; T4, 45 cultivos. Que, para evaluar los porcentajes de cultivos asépticos y contaminados, de cada tratamiento se tuvieron 5, 6, 36 y 6 repeticiones, respectivamente. Y cada repetición con 13 a 14 cultivos.
Las variables evaluadas fueron: (%) contaminación, (%) de cultivos asépticos viables (aumento de volumen debido a divisiones celulares, cambio de pigmentación de color amarillo muy claro a verde, debido a clorofila; cambio de textura de liso a granulado, debido a posibles iniciales de brotes) y % de cultivos viables en que hubo formación de brotes. Los datos en porcentajes se transformaron con arcsen (√x), el resto de los datos se analizó sin transformar. Se realizó Anova y prueba de Tukey (p ≤ 0.05) y para las rutinas de análisis estadísticos se usó el paquete computacional SAS ver. 9.4 (2019).
En Agave angustifolia se ha reportado su micropropagación con descripción de todas las etapas desde el manejo de las plantas durante la etapa 0 en vivero y las posteriores de cultivo in vitro: establecimiento de cultivos asépticos, multiplicación de propágulos mediante formación de brotes adventicios, enraizado de los brotes, la transferencia de las plantas micropropagadas a sustrato e invernadero para su aclimatación (Ríos-Ramírez et al., 2018). También se ha descrito el desarrollo de las plantas en vivero hasta que tienen tamaño para su transferencia a campo. En 1987 en Oaxaca, México, se establecieron las primeras ocho mil plantas micropropagadas en cultivos en campo y se cosecharon de 7 a 9 años después, para su uso como materia prima para la agroindustria de mezcal (Enríquez-del Valle, 2008).
La experiencia muestra que es posible evaluar modificaciones en las diversas etapas del procedimiento para aumentar su eficiencia. Y el presente trabajo fue para reducir los niveles de contaminación en la etapa I. Abreu et al. (2016) al propagar A. fourcroydes usaron antibióticos en el medio de cultivo, hasta 50 mg L-1 de Ticarcilina y hasta 100 mg L-1 de Cefotaxima, que inhibieron el crecimiento de bacterias contaminantes. Mientras que para cultivos in vitro de A. tequilana, Obledo-Vázquez et al. (2004) incorporaron al medio de cultivo un extracto comercial de toronja (citricidal®), como alternativa al uso de antibióticos.
La Figura 1 muestra la condición de las plantas en la etapa 0 en vivero (Figura 1a), los tallos que se llevaron de vivero a laboratorio (Figura 1b), tejidos de tallo que en la etapa I se establecieron en medio de cultivo (Figura 1c) y brotes adventicios que se formaron en tejidos de tallo, vía organogénesis (Figura 1d).
Cuando el cultivo in vitro inicia a partir de tejidos del tallo, que es una estructura de la planta que en vivero está en estrecho contacto con el suelo y en sus tejidos hay poblaciones de microorganismos endógenos, la eficiencia de tratamientos para eliminar microorganismos es limitada. Ríos-Ramírez et al. (2018) reportaron que, al micropropagar A. angustifolia, en la etapa I, entre 38.7 y 83.4% de los cultivos se contaminó, mientras que López-Acevedo et al. (2018) reportan que 29.8% de los tejidos de tallo que establecieron in vitro, resultaron asépticos, viables, con formación de brotes adventicios.
En los trabajos citados, así como en el presente, se coincide con Debergh y Maene (1981) sobre la importancia de la etapa 0 de manejo previo de las plantas en vivero, para reducir la incidencia de contaminación de tejidos vegetales cuando se establezcan in vitro. Los análisis de varianza (Cuadro 1) muestran que las etapas de propagación tuvieron diferencias de efecto altamente significativas (p ≤ 0.01) en los porcentajes de cultivos que se obtuvieron asépticos, de cultivos contaminados, de cultivos que se obtuvieron viables, y efectos significativos (p ≤ 0.05) en la cantidad de brotes formados en los explantos.
| FV | GL | Arcsen aséptico (%) | Arcsen contaminados (%) | Arcsen viables (%) | NB |
|---|---|---|---|---|---|
| Trat | 3 | 9 980** | 10 633** | 10 679.91** | 0.77* |
| Error | 49 | 256.13 | 164.21 | 123.09 | 0.17 |
| Total | 52 |
Conforme los tejidos de agave son de edad mayor se dificulta cortarlos debido a que sus fibras tienen paredes celulares de grosor mayor en comparación a tejidos de tallos jóvenes. Así también aumenta la probabilidad de tener en sus tejidos microorganismos endófitos, por lo que se tomó en cuenta este factor. Durante los primeros 10 días de incubación de cultivos de la etapa I, se diagnosticaron los microorganismos contaminantes de los géneros Fusarium y Aspergillus, así como bacterias gram negativas, en los tejidos cultivados in vitro, las evidencias muestran que del total de tejidos de tallo de agave que se establecieron in vitro, solo el 3.68% y 8.73% de los tejidos de tallo en el tratamiento 1 y en el tratamiento 2, se lograron asépticos, respectivamente.
Sin embargo, algunos cultivos de tejidos de tallo que se contaminan se mantienen viables y ocurrió la organogénesis de brotes, por lo que estos tejidos de tallo se sometieron al tratamiento 4 y en 52% de éstos se logró eliminar los microorganismos (Cuadro 2).
[i] T1= explantos de plantas de dos años y T2= explantos de plantas de cinco años, para el establecimiento de cultivos asépticos; T3= brotes de cultivos asépticos; T4= brotes obtenidos in vitro, contaminados, que se desinfectaron superficialmente y establecieron en medio de cultivo con antibióticos; C= porcentajes de contaminados; CAV= porcentajes asépticos viables; NBN= número de brotes nuevos. Los datos muestran el promedio ±error estándar. En cada columna promedios con la misma letra no son significativamente diferentes (Tukey, 0.05).
La contaminación microbiana en la etapa I se debió a microorganismos endógenos presentes en los tejidos del tallo, aun cuando se les aplicaron ya que los fungicidas y antibióticos aplicados en vivero (etapa 0). La desinfección superficial empleada resultó ineficaz contra estos contaminantes internos, pues los desinfectantes actúan superficialmente. Se descarta contaminación por manipulación inadecuada, esterilización deficiente de materiales o medios de cultivo. Similarmente, Sánchez-Cuevas y Salaverria (2004) señalan que en fresa la pubescencia y el contacto con el suelo favorecen la presencia de endófitos difíciles de eliminar al establecer cultivos in vitro.
Al lograr cultivos de tejidos de tallo en la etapa I, asépticos y viables, en los que ocurrió la formación de brotes, éstos se transfirieron a nuevo medio de cultivo. Transcurridas ocho semanas el 89.88% de cultivos mantuvo su condición de asepsia, el 100% fueron viables y en todos ocurrió la formación de 1.07 nuevos brotes en promedio (Cuadro 2). El porcentaje alto de cultivos viables, en que ocurrió formación de nuevos brotes, en la etapa II, es debido a que los materiales vegetales ya no se someten al procedimiento de desinfección superficial, pues dicho procedimiento que en la etapa I se aplicó a los tejidos vegetales para eliminar microorganismos, también daña al material vegetal.
Cuando en la etapa I, ocurrió la organogénesis de brotes adventicios a partir de tejidos de tallo, pero estos cultivos estaban contaminación por bacterias, se extrajeron del medio de cultivo para someterlos al tratamiento 4, que incluyó la desinfección superficial y entonces se establecieron en un medio de cultivo para inducir organogénesis, pero que además contenía los antibióticos cloranfenicol 100 mg L-1 y ampicilina 0.1 g L-1. Transcurridos 20 días de incubación el 52.5% ya no mostraban crecimiento de hongos o bacterias, significativamente (Tukey, 0.05) menor en comparación a la contaminación de cultivos en la etapa I. En ensayos previos a este experimento se determinaron las dosis de antibióticos usadas en el tratamiento 4. Cuando las sustancias cloranfenicol y ampicilina se agregaron al medio de cultivo en concentraciones mayores a las que se indican como efectivas, produjeron fitotoxicidad, ocurriendo necrosis en los tejidos.
En cultivos in vitro de Agave angustifolia, el nivel de contaminación microbiana varía según la etapa de propagación. En la etapa I, la mayoría de las contaminaciones (91.2-96.3%) provienen de microorganismos endógenos presentes en los tejidos del tallo, que no se eliminan con fungicidas, antibióticos en vivero ni desinfestación superficial. Sin embargo, en brotes adventicios ya formados pero contaminados por bacterias, un tratamiento adicional de desinfección más establecimiento en medio de cultivo con antibióticos permitió recuperar el 52.5% de los explantos como asépticos.
La procedencia del material vegetal es clave para el éxito de la propagación in vitro. Cuando se partió de cultivos asépticos en la etapa I y se subdividieron los racimos de brotes para la etapa II (multiplicación de propágulos), la contaminación se redujo drásticamente a solo 10.1%, todos los cultivos permanecieron viables y se obtuvo formación de nuevos brotes.
Los datos del artículo se obtuvieron por el apoyo de la Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación (SECIHTI), México, a la primera autora con una beca nacional para estudios de posgrado.
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