elocation-id: e4247
El porcentaje de semillas poliembriónicas y el número de embriones por semilla NE son variables comúnmente utilizadas para estimar el grado de poliembrionía en cítricos, característica utilizada como indicador de propagación clonal o vegetativa de genotipos seleccionados. Sin embargo, muchos estudios omiten la descripción de los métodos empleados para determinar el tamaño de muestra adecuado en la cuantificación de estas variables. El objetivo del presente trabajo fue proponer una metodología estadística robusta para calcular el tamaño de muestra óptimo en estudios de poliembrionía en cítricos, utilizando el método de máxima distancia y la prueba F. Se evaluaron cinco genotipos de cítricos (Citrange C-35, limón Volkameriano, mandarino Amblicarpa, naranja Valencia y tangelo Mineola) durante dos ciclos de cosecha (2020 y 2021), contabilizando el número de embriones en 100 semillas por genotipo. Dado que la variable número de embriones por semilla, no presentó una distribución normal, se aplicó el método de máxima distancia usando coeficientes de variación calculados con la media winsorizada y un procedimiento bootstrap no paramétrico. Los resultados indicaron tamaños óptimos de muestra entre 26 y 28 semillas, con coeficientes de variación entre 6% y 11%, dependiendo del genotipo. Se concluyó que, para los genotipos evaluados, el análisis de muestras de hasta 50 semillas resulta suficiente para estimar con precisión el grado de poliembrionía.
apomixis, bootstrap no paramétrico, cítricos, método de máxima distancia.
La poliembrionía en cítricos es una característica de gran relevancia agronómica, ya que permite la obtención de plantas genéticamente idénticas a la planta madre a través de semillas, lo que constituye una ventaja estratégica para la propagación comercial de genotipos seleccionados (Duarte et al., 2013). Este tipo de reproducción asexual, conocida como apomixis adventicia esporofítica, se origina a partir del tejido nucelar del ovario y da lugar a la formación de embriones somáticos que coexisten con el embrión cigótico dentro de una misma semilla (Martínez-Ochoa et al., 2012). Como resultado, la germinación de embriones nucelares permite conservar la identidad genética del genotipo, mientras que la emergencia ocasional de embriones sexuales puede generar segregación genética.
Además de su importancia genética, la propagación mediante semillas poliembriónicas ofrece ventajas operativas frente a otros métodos vegetativos, tales como la reducción del riesgo de transmisión de patógenos y la facilidad para el transporte y manejo del material vegetal entre regiones o países (Andrade-Rodríguez et al., 2003; Kishore et al., 2012; Villegas-Monter et al., 2023). Por estas razones, la poliembrionía ha sido ampliamente estudiada en cítricos, particularmente a través de dos variables clave: el porcentaje de semillas poliembriónicas y el número de embriones por semilla, las cuales se utilizan como indicadores del potencial de propagación clonal de los genotipos evaluados (Martínez-Ochoa et al., 2012; Duarte et al., 2013).
No obstante, a pesar de la abundancia de estudios sobre poliembrionía en cítricos, la mayoría de las investigaciones no reportan de manera explícita la metodología empleada para determinar el tamaño de muestra utilizado en la cuantificación de estas variables. En la literatura se observan tamaños muestrales altamente variables, que oscilan entre 100 y 1 000 semillas, sin una justificación estadística clara (Andrade-Rodríguez et al., 2003; Darlan-Ramos et al., 2006; Kishore et al., 2012). Esta omisión limita la reproducibilidad de los estudios y puede conducir a un uso ineficiente de los recursos experimentales.
Algunos trabajos han intentado atender esta problemática mediante la estimación del tamaño de muestra a partir del coeficiente de variación, utilizando el método de la curvatura máxima. Tal es el caso de Santos et al. (2015) en cítricos y Arellano-Durán et al. (2018) en mango. Sin embargo, estos enfoques se basan en supuestos de normalidad y en el uso de la media aritmética como estimador de tendencia central, lo cual puede resultar inadecuado cuando los datos presentan distribuciones asimétricas o valores atípicos, una condición frecuente en variables biológicas como el número de embriones por semilla (Leys et al., 2013).
La determinación adecuada del tamaño de muestra constituye un elemento fundamental en el diseño experimental, ya que permite optimizar la precisión de las estimaciones y el uso de los recursos disponibles (Avanza et al., 2010). Tradicionalmente, este cálculo se apoya en medidas de dispersión relativas a la media aritmética; sin embargo, cuando los datos no cumplen con el supuesto de normalidad, la media puede verse fuertemente influenciada por valores extremos, lo que distorsiona la estimación del coeficiente de variación y en consecuencia, del tamaño de muestra requerido.
Ante este escenario, el uso de métodos estadísticos robustos y no paramétricos representa una alternativa adecuada para el análisis de variables con comportamiento asimétrico. Entre estos métodos destacan la winsorización, que reduce la influencia de valores atípicos sobre los estimadores de tendencia central y dispersión (Barnett y Lewis, 1994), y el bootstrap no paramétrico, que permite estimar parámetros poblacionales sin asumir una distribución teórica específica de los datos (Efron y Tibshirani, 1986). Estas técnicas han demostrado su utilidad en estudios biológicos y agronómicos con alta variabilidad (Martínez-Ochoa et al., 2012).
En este contexto, el objetivo del estudio fue proponer una metodología estadística robusta para estimar el tamaño de muestra óptimo en estudios de poliembrionía en cítricos, particularmente cuando la variable número de embriones por semilla no cumple con el supuesto de normalidad. Para ello, se evaluaron cinco genotipos de cítricos y se aplicó el método de máxima distancia, utilizando coeficientes de variación winsorizados estimados mediante bootstrap no paramétrico, complementados con una prueba F para la validación objetiva del tamaño de muestra seleccionado.
Se recolectaron diez frutos maduros por genotipo provenientes de árboles con polinización abierta de los siguientes cítricos: naranja Valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck), tangelo Mineola (C. paradisi Macf. × C. reticulata Blanco), citrange C-35 (C. sinensis × Poncirus trifoliata), limón Volkameriano (C. volkameriana Pasq.) y mandarino Amblicarpa (C. amblycarpa (Hassk.) Ochse). La colecta se realizó durante dos ciclos productivos consecutivos (2020 y 2021) en huertos del vivero ‘Cazones’, Veracruz, México (20°42’ latitud norte; 97°18’ longitud oeste; 23 msnm).
De cada fruto se seleccionaron al azar diez semillas viables, integrando una premuestra de 100 semillas por genotipo y por ciclo. La unidad de muestreo fue una semilla. A cada semilla se le retiró manualmente la testa y el tegmen para exponer los embriones, los cuales se separaron y contaron individualmente para registrar el número de embriones por semilla (NE).
La normalidad de la variable NE se evaluó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov y la presencia de valores atípicos se identificó mediante diagramas de caja. Dado que la variable no cumplió con el supuesto de normalidad y presentó valores extremos, se descartó el uso de la media aritmética como estimador de tendencia central para la determinación del tamaño de muestra. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software SAS (SAS Institute, 2003).
Se estimó el coeficiente de variación winsorizado por bootstrap () a partir de la media winsorizada () y la desviación estándar winsorizada (). Para ello, se generaron B = 200 réplicas bootstrap no paramétricas, de acuerdo con Efron y Tibshirani (1986); Ramírez et al. (2013), con el fin de calcular con precisión el en cada genotipo. 1) se generaron B muestras bootstrap independientes , obtenidas con reemplazo a partir del conjunto de datos original ; 2) se evaluó las réplicas bootstrap del estimador correspondiente a cada muestrea: desde b = 1, ⋯, B; y 3) se estimó como el promedio de las B réplicas del estimador, mediante la siguiente expresión:
Donde la media winsorizada es:
es la desviación estándar winsorizada (); n = es el tamaño de la muestra; y α se refiere a una proporción de observaciones a winsorizadas en cada extremo o cualquier extremo (0.1, 0.2). Conforme a Erceg y Mirošević (2008), se aplicó una winsorización del 20%, sustituyendo el 10% de los valores en cada extremo por los valores más cercanos dentro del rango restante. En la siguiente expresión se aplicó este criterio para estimar la varianza winsorizada y en consecuencia, el coeficiente de variación:
Donde: es la varianza winsorizada y B es el número de réplicas; cuando B → ∞, el estimador bootstrap del coeficiente de variación winzorizado converge al estimador boostrap ideal, lo cual implica que converge a .
Los coeficientes de variación winsorizados (CVw) se estimaron para diferentes tamaños de muestra y se representaron en función de n. Se ajustó un modelo potencial de la forma: y = ax-b, propuesto por Lessman y Atkins (1963). Donde a y b son parámetros estimados. Con base en este ajuste, el criterio de curvatura máxima define como tamaño de muestra óptimo el punto de la curva en el cual incrementos adicionales de n no generan reducciones relevantes en el coeficiente de variación winsorizado (CVw). La localización de este punto puede realizarse mediante inspección visual, procedimiento de carácter subjetivo o de manera objetiva mediante el método de máxima distancia (MMD) (Paranaiba et al., 2009). En este estudio se aplicó el MMD conforme a lo descrito por Lorentz et al. (2012) (Figura 1).
El MMD identifica el tamaño de muestra óptimo como el punto de la curva de ajuste yc, descrita por la función y = ax-b; es decir, yc = ax-b, que máxima la distancia respecto a una recta secante yr trazada entre dos puntos de la misma curva. Para ello se define una recta perpendicular yp = ex + f a la secante yr, la cual intersecta la curva yc en el punto donde dicha distancia es máxima, correspondiente al tamaño de muestra óptimo.
La recta secante yr se definió a partir de los puntos por (xcri, ycri) y por (xcrf, ycrf). Su coeficiente angular c se calculó como: c = (ycrf - ycri)/(xcrf - xcri) y el coeficiente de linealidad d se obtuvo a partir de la ecuación de la recta d = ycri - cxcri o d = ycrf - cxcrf. El coeficiente angular e de la recta perpendicular yp se determinó mediante la condición de perpendicularidad entre ambas rectas: e = -1/c. Este procedimiento permitió identificar de manera objetiva el punto de máxima distancia entre la curva yc y la recta yr, el cual representa el punto de curvatura máxima y por tanto, el tamaño de muestra óptimo.
El coeficiente lineal f de la recta yp se obtuvo mediante el procedimiento interactivo descrito por Lorentz et al. (2012), a partir de: xrpj = (f - d)/(c - e). La distancia entre los puntos (xcj, ycj) y (xrpj, yrpj), ubicada sobre la recta ypj, perpendicular a yr, se calculó como:
Con base en lo anterior, el procedimiento para aplicar el MMD se desarrolló como sigue: 1) se tomaron valores sobre el eje x, entre el intervalo [xcri, xcrf] a un espaciamiento Δx = (xcrf - xcri)/n. Donde: n es el número de intervalos en los que se dividió el dominio de la función; 2) para cada valor x (con j = 1,…,n), se calculó yc(xj) y hacer yc(xj) = yp(xj); es decir, la recta yp, perpendicular a la recta yr, intercepta la curva yc en xj; 3) los valores yc(xj) y yp(xj) se denominaron ycj y ypj, respectivamente; 4) el coeficiente f se obtuvo sustituyendo el punto (xj, ypj) en la ecuación de yp, de manera que f = ypj - exj; 5) se determinó el punto de intersección (xrpj, yrpj) entre las rectas yr y ypj, resolviendo el sistema yrpj = cxrpj + d; yrpj = exrpj + f, cuya solución es: xrpj = (f - d)/(c - e); y 6) se calculó la distancia entre (xcj, ycj), y (xrpj, yrpj). Este procedimiento se repitió para j = 1, ⋯, n en todo el intervalo [xci, xcf]; y se identificó el valor máximo dcrmáx y las coordenadas correspondientes xcmáx, ycmáx. El valor dcrmáx se consideró la distancia máxima entre la curva yc y la recta yr, medida sobre un segmento perpendicular a yr. El punto (xcmáx, ycmáx) determinó el tamaño de muestra óptimo.
Como criterio complementario, se aplicó una prueba F para evaluar la homogeneidad de varianzas entre tamaños de muestra consecutivos. Esta prueba se fundamentó en la comparación de varianzas absolutas, dado que en el diseño experimental el interés principal es minimizar el error experimental, representado por la varianza (Gómez y Gómez, 1984). El estadístico F se calculó como el cociente entre dos varianzas consecutivas. Las hipótesis planteadas fueron: Ho: Var(x)i = Var(x)j vs H1: Var(x)i ≠ Var(x)j, para toda i ≠ j. Con un nivel de significancia α = 0.05, se rechazó Ho cuando p < 0.05. En los casos en los que no se detectaron diferencias significativas entre varianzas consecutivas, se consideró que incrementos adicionales en el tamaño de muestra no producían reducciones significativas en la variabilidad.
La variable número de embriones por semilla (NE), evaluada en cinco genotipos de cítricos durante los ciclos de cosecha 2020 y 2021, no cumplió con el supuesto de normalidad de acuerdo con la prueba de Kolmogorov-Smirnov (p ≤ 0.05). En todos los genotipos se observaron distribuciones asimétricas positivas, caracterizadas por una alta dispersión del NE respecto a su media en cada genotipo. Este patrón de distribución es consistente con lo reportado para especies poliembriónicas, en las cuales la formación de embriones nucelares está regulada por uno o pocos genes, pero puede verse modulada por factores ambientales y fisiológicos que incrementan la variabilidad intraespecífica (Andrade-Rodríguez et al., 2003; Kepiro y Roose, 2010). En particular, en el genotipo tangelo Mineola se registraron valores máximos de hasta 13 embriones por semilla, aun cuando la media se situó alrededor de cuatro embriones, lo que evidencia una marcada dispersión respecto a la media aritmética.
El análisis exploratorio permitió identificar valores atípicos en todos los genotipos evaluados. En Amblicarpa, C-35 y Mineola se consideraron atípicas las semillas con más de nueve embriones, mientras que en Valencia y Volkameriano este umbral correspondió a ocho y siete embriones, respectivamente. La presencia sistemática de estos valores extremos confirma que la media aritmética no constituye un estimador robusto del NE, tal como lo señalan Leys et al. (2013) para variables con distribuciones asimétricas.
Como consecuencia de esta estructura de datos, los coeficientes de variación calculados a partir de la media aritmética, sin aplicar métodos robustos, fueron elevados y oscilaron entre 35% y 63% entre genotipos y ciclos de cosecha. Estos valores reflejan una alta variabilidad relativa del NE y limitan su utilidad como criterio confiable para la determinación del tamaño de muestra. La aplicación de la winsorización permitió reducir de manera sustancial la influencia de los valores extremos sobre la estimación de la variabilidad. Al emplear la media winsorizada, los coeficientes de variación se redujeron de forma consistente en todos los genotipos. Por ejemplo, en Valencia los coeficientes de variación disminuyeron de 35% y 50% a valores entre 19% y 28%; en Mineola de 41-43% a 34-38%; en C-35 de 44% a 24-28%; en Volkameriano de 52-63% a 24-30% y en Amblicarpa de 41-46% a 25-26%, considerando ambos ciclos de evaluación. Estos resultados concuerdan con lo señalado por Barnett y Lewis (1994), quienes destacan la utilidad de los estimadores robustos para controlar la variabilidad inducida por valores atípicos.
Los coeficientes de variación winsorizados del número de embriones por semilla (NE) se estimaron mediante bootstrap no paramétrico con reemplazo, utilizando 200 réplicas, y se presentan en los Cuadros 1 y 2 para los ciclos 2020 y 2021, respectivamente; este enfoque permitió cuantificar la variabilidad de NE sin asumir una distribución teórica, lo cual es apropiado para variables biológicas con comportamiento asimétrico (Efron y Tibshirani, 1986; Davison y Hinkley, 1997).
La elección de 200 réplicas se justificó por la variación del coeficiente de variación entre genotipos y ciclos, y se encuentra dentro del rango recomendado para obtener estimaciones estables del error estándar y de los estimadores de varianza en contextos de alta variabilidad (Efron y Tibshirani, 1986; Ramírez et al., 2013). En todos los genotipos se observó una disminución progresiva del coeficiente de variación a medida que aumentó el tamaño de muestra (Cuadro 1 y 2), con reducciones pronunciadas hasta aproximadamente 20 semillas y una tendencia asintótica a partir de tamaños de muestra cercanos a 60-70 semillas. Este comportamiento es característico de los ensayos de uniformidad empleados para definir tamaños óptimos de muestreo en estudios agronómicos (Lessman y Atkins, 1963; Paranaiba et al., 2009).
La aplicación del (MMD) permitió identificar de manera objetiva el punto de curvatura máxima de la relación entre el coeficiente de variación winsorizado y el tamaño de muestra, evitando la subjetividad asociada a la inspección visual del método de curvatura máxima tradicional (Paranaiba et al., 2009; Arellano-Durán et al., 2018). Con base en este criterio, el tamaño de muestra óptimo estimado para los cinco genotipos, considerando ambos ciclos de cosecha, se ubicó en un rango de 26 a 28 semillas. En dichos tamaños de muestra, los coeficientes de variación oscilaron entre 6.01% y 11%, lo que indica una variabilidad controlada y una precisión adecuada en la estimación del NE.
En estudios previos que emplearon el método de curvatura máxima para determinar el tamaño de muestra en especies poliembriónicas, Santos et al. (2015) reportaron un rango de 10 a 23 semillas en 15 genotipos de cítricos, mientras que Arellano-Durán et al. (2018) recomendaron analizar ocho semillas poliembriónicas en cultivares de mango Manila y Ataulfo. No obstante, en ambos casos no se especifica si los datos cumplieron con el supuesto de normalidad, condición necesaria para justificar el uso del coeficiente de variación como criterio de estimación.
Adicionalmente, la prueba F aplicada como criterio complementario para la validación del tamaño de muestra mostró que, en la mayoría de los genotipos, no se detectaron diferencias significativas entre varianzas consecutivas a partir de tamaños de muestra entre 30 y 50 semillas, dependiendo del genotipo y del ciclo de cosecha. En particular, en Valencia no se observaron diferencias significativas a partir de 30 semillas, en Volkameriano a partir de 50 semillas y en Amblicarpa, C-35 y Mineola a partir de 40 semillas. Estos resultados indican que incrementos adicionales en el tamaño de muestra no producen reducciones significativas en la variabilidad absoluta, en concordancia con lo señalado por Gómez y Gómez (1984).
En conjunto, el MMD permitió identificar un tamaño de muestra óptimo entre 26 y 28 semillas, mientras que la prueba F sugirió rangos ligeramente más amplios (30-50 semillas), en función del genotipo; esta convergencia entre criterios respalda la solidez del enfoque y ofrece un marco objetivo para seleccionar tamaños de muestra en estudios de poliembrionía en cítricos. Con base en ambos resultados y considerando la estabilidad observada en dos ciclos de cosecha, se recomienda analizar 27-40 semillas en Amblicarpa, 26-50 en Volkameriano, 26-30 en Valencia y 26-40 en C-35 y Mineola. En este sentido, el método propuesto representa una alternativa robusta para variables que no cumplen normalidad, ya que definir tamaños de muestra adecuados mejora la precisión de los estimadores, fortalece la confiabilidad de las inferencias y puede extrapolarse a otras especies y variables cuantitativas con distribuciones asimétricas, ampliando su utilidad en distintos contextos experimentales.
Los resultados de este estudio muestran que la winsorización, combinada con un procedimiento bootstrap no paramétrico, constituye una estrategia eficaz para estimar el tamaño de muestra en estudios de poliembrionía en cítricos, particularmente cuando la variable número de embriones por semilla presenta asimetría y valores atípicos. La aplicación del método de máxima distancia, complementado con la prueba F, permitió definir de manera objetiva que un tamaño de muestra entre 26 y 50 semillas es suficiente para obtener estimaciones precisas y con variabilidad controlada en los cinco genotipos evaluados. En conjunto, la metodología propuesta contribuye a la estandarización del muestreo en semillas poliembriónicas de cítricos y ofrece un procedimiento replicable para otras especies y variables cuantitativas con distribuciones no normales.
Villegas-Monter, A.; Martínez-Ochoa, E. D. C.; Andrade-Rodríguez, M. and Villegas-Velásquez, I. 2023. Citrus polyembryony. In: Gonzatto-Pereira, M. and Santos, J. S. (Eds.). Advances in citrus research horticultural and human health aspects. London, UK. 1-15 pp. http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.105994.