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Este estudio explora el papel de Bradyrhizobium sp. ( Lotus ) en la mejora de la resiliencia bioquímica de Lotus ornithopodioïdes durante la germinación bajo condiciones de estrés por metales. Específicamente, se evaluaron los efectos del cadmio (Cd) y el cobre (Cu) sobre la germinación y diversos parámetros bioquímicos. Las semillas se inocularon con Bradyrhizobium sp. ( Lotus ) y se sometieron a diferentes concentraciones de metales traza. Se analizaron parámetros bioquímicos clave, incluidos la prolina, los aminoácidos, los azúcares solubles totales, la actividad de α-amilasa y el contenido de ADN. Los resultados demostraron que la inoculación con Bradyrhizobium sp. ( Lotus ) mitigó significativamente los efectos adversos del estrés por metales, lo que llevó a una mejora de las tasas de germinación y un aumento de las respuestas bioquímicas. Cabe destacar que los niveles de prolina y de aminoácidos disminuyeron, mientras que la actividad de α-amilasa y el contenido de ADN aumentaron en las semillas inoculadas en comparación con las semillas de control no inoculadas. Estos hallazgos sugieren que Bradyrhizobium sp. ( Lotus ) desempeña un papel esencial en la promoción de la resiliencia en Lotus ornithopodioïdes bajo estrés por metales, lo que destaca su potencial para su uso en la biorremediación y en prácticas agrícolas sostenibles.
bioquímica, cadmio, cobre, germinación, estrés por metales, RPCV, trébol.
La contaminación por metales pesados en los suelos agrícolas es una preocupación creciente a nivel global, lo que plantea desafíos significativos para la producción agrícola y la seguridad alimentaria ( Rizwan et al ., 2016 ). Metales traza tóxicos como el cadmio (Cd) y el cobre (Cu) pueden afectar gravemente la germinación de las semillas, el crecimiento de las plantas y el rendimiento general de los cultivos ( Hossain et al ., 2012 ).
La creciente presencia de metales pesados y traza en los sistemas agrícolas exige estrategias sostenibles y ecológicas para reducir el estrés de las plantas. Un enfoque eficaz es el uso de interacciones planta-microbioma, especialmente las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (RPCV) ( Etesami y Maheshwari, 2018 ).
Las especies de Bradyrhizobium son RPCV bien conocidas que mejoran el crecimiento, la absorción de nutrientes y la tolerancia al estrés en legumbres, incluida la mitigación del estrés por metales ( Ahemad y Kibret, 2014 ; Shameer y Prasad, 2018 ). Sin embargo, los mecanismos por los cuales Bradyrhizobium sp. ( Lotus ) modula las respuestas bioquímicas de Lotus ornithopodioïdes L. durante la germinación bajo estrés por metales siguen siendo poco comprendidos.
La investigación se centra en evaluar el impacto de la inoculación con Bradyrhizobium sp. ( Lotus ) sobre parámetros bioquímicos clave, incluidos la prolina, los aminoácidos, los azúcares solubles totales, la actividad de α-amilasa y el contenido de ADN, bajo diferentes concentraciones de metales traza.
Se utilizó Bradyrhizobium sp. ( Lotus ), descrito por Degaichia et al . (2024) , a una concentración de 108 UFC ml-1.
La germinación de las semillas de Lotus ornithopodioïdes L. y la prueba se llevaron a cabo según el protocolo de trabajo de Degaichia et al . (2025) .
La inoculación de semillas con Bradyrhizobium sp. ( Lotus ) se realizó con base en Silini et al . (2016) . Las semillas se germinaron en placas de Petri (20 semillas por placa) sobre papel de filtro humedecido con agua destilada (control) o con soluciones de CdCl2 y CuCl22H2O ( Degaichia et al ., 2025 ) ( Cuadro 1 ). La germinación se realizó en la oscuridad a 25 °C.
| Cu(II) | Cd(II) | Cu(II):Cd(II) |
|---|---|---|
| 1.5 | 2 | 1.5:2 …. I |
| 2 | 3.5 | 2:3.5…. II |
| 3 | 6 | 3:6 …. III |
Después de tres días de incubación, se realizó el análisis de los parámetros bioquímicos ( Degaichia et al ., 2025 ).
El contenido de prolina se determinó mediante el método desarrollado por Singh et al . (1973) . La absorbancia se leyó a 520 nm. Los resultados se reportan en una curva estándar de prolina.
Las muestras se almacenaron a menos de -15 °C antes del análisis. La extracción se realizó según el método descrito por Naidu et al . (1998) . Los resultados se expresaron en μmoles de equivalentes de leucina por gramo de materia fresca (μM equiv leucina g-1 MF).
La extracción de azúcares se realizó según Babu et al . (2002) . La determinación de los azúcares solubles totales se llevó a cabo mediante el método de Dubois ( Dubois et al ., 1956 ). Los resultados de las densidades ópticas se informaron en la curva estándar de azúcares solubles (expresada como glucosa).
La alfa-amilasa se midió según el método de Xiao et al . (2007) . Los resultados se expresaron en unidades enzimáticas por mililitro (U ml-1), calculadas según la siguiente fórmula:
Donde: A580T= absorbancia del almidón sin añadir el extracto enzimático; A580E= absorbancia del almidón tras la adición del extracto enzimático; A580ET= absorbancia para 1 mg de almidón derivada de la curva estándar; T= tiempo de incubación en minutos; Vext= volumen del extracto enzimático añadido en mililitros.
El ADN se midió según la técnica utilizada por Burton (1956) . La lectura de la densidad óptica de las muestras se realizó a 600 nm (DO600). El contenido de ADN se determina según la fórmula:
En todos los cuadros, Conc denota concentración en MT; N ino e Ino indican semillas no inoculadas e inoculadas con Bradyrhizobium sp. ( Lotus ), respectivamente. Los valores representan las medias. Letras mayúsculas diferentes dentro de filas y letras minúsculas dentro de columnas indican diferencias significativas según la prueba t de Student y la prueba de Tukey, respectivamente (p≤ 0.05).
En el control se registra un valor de 0.97 μg g-1 MF para el contenido de prolina; este valor aumenta significativamente con el incremento de la concentración de Cd(II) y alcanza 1.41 μg g-1 MF a 6 g L-1 de Cd(II). En un medio de cobre, el contenido de prolina se correlaciona positivamente con la concentración, donde se registra un máximo de 1.55 μg g-1 MF para la concentración de 3 g L-1. La mezcla de ambos elementos también genera aumentos significativos en comparación con el control ( Cuadro 2 ).
La inoculación bacteriana reduce significativamente el nivel de prolina en comparación con las pruebas no inoculadas. De hecho, en el control se registra un contenido de prolina de 0.24 μg g-1 MF, un valor significativamente bajo en comparación con la prueba inoculada (0.97 μg g-1 MF).
El estrés por metales aumentó significativamente el contenido de aminoácidos (AA) en las muestras tratadas. Sin inoculación, los niveles de AA aumentaron más del doble (200.66%) con 2 g L-1 de Cd(II) en comparación con el control. Bajo estrés por Cu(II), el contenido de AA aumentó proporcionalmente con la concentración, alcanzando 0.135, 0.185 y 0.19 μM equiv leucina g-1 MF a 1.5, 2 y 3 g L-1, respectivamente. En contraste, en el tratamiento combinado de metales, el contenido de AA aumentó a medida que disminuían las concentraciones de metales ( Cuadro 3 ).
La inoculación de semillas con Bradyrhizobium sp. ( Lotus ) reduce significativamente el contenido de AA. De hecho, se observó una caída significativa del 8.37 al 18.66% en el contenido de AA para todas las concentraciones en comparación con las pruebas no inoculadas. También se observó que los contenidos de AA aumentan con el incremento de la concentración de Cd(II) en el medio y del MT asociado.
En semillas no inoculadas, el contenido de azúcares solubles totales aumentó significativamente en todos los tratamientos con metales individuales y sus mezclas en comparación con el control (3.74 μg g-1 MF). Los niveles de azúcar aumentaron con el aumento de las concentraciones de metales. En cambio, la inoculación con Bradyrhizobium sp. ( Lotus ) redujo significativamente el contenido de azúcares solubles totales en comparación con las semillas no inoculadas ( Cuadro 4 ).
En ausencia de inoculación bacteriana, se observa una actividad de amilasa muy baja en el control (5.74 x 10-5 U ml-1). El contenido de α-amilasa aumenta ligeramente con el incremento de la concentración de Cd(II) y Cu(II), donde el aumento de la concentración de la mezcla de ambos elementos provoca una caída en la α-amilasa y alcanza 2.55 x 10-5 U ml-1 ( Cuadro 5 ).
La inoculación de semillas de trébol con Bradyrhizobium sp. ( Lotus ) aumentó significativamente la actividad de la α-amilasa en comparación con los controles no inoculados, los cuales mostraron 61.1×10-5 U ml-1. La actividad de la amilasa disminuyó progresivamente con el aumento de la concentración de Cu(II), con la actividad más baja observada en los tratamientos con mezcla de Cu(II)+Cd(II) (0.97×10-5 U ml-1 a la concentración III).
Sin preinoculación bacteriana de las semillas de trébol, se observaron bajos contenidos de ADN en las pruebas tratadas en comparación con el control (26.35 μmol g-1 MS), salvo en la concentración II del medio que contenía la mezcla Cu(II)+Cd(II), donde el contenido de ADN aumenta significativamente en un 58.56% (41.76 μmol g-1 MS) ( Cuadro 6 ).
En ausencia de Bradyrhizobium sp. ( Lotus ), el contenido de ADN fue notablemente bajo, con ligeros aumentos a concentraciones más altas de MT. La inoculación con Bradyrhizobium sp. ( Lotus ) aumentó significativamente el contenido de ADN en todos los tratamientos con metales en comparación con el control (29.23 μmol g-1 MS). No obstante, los niveles de ADN en las semillas de trébol disminuyeron significativamente con el aumento de las concentraciones de metales individuales y de sus mezclas.
La prolina representa menos del 5% de los aminoácidos libres totales y se reconoce como uno de los metabolitos de estrés más prevalentes ( Matysik et al ., 2002 ; Sharma y Dietz, 2006 ; Lei et al ., 2007 ). Desempeña múltiples funciones, entre ellas la osmorregulación, la quelación y la desintoxicación de metales pesados, la protección enzimática, la regulación del pH citosólico, la estabilización de la maquinaria de síntesis de proteínas y la captura de especies reactivas de oxígeno (ERO) ( Sharmila et al ., 2002 ).
En nuestro estudio, el contenido de prolina aumentó con la exposición al cadmio (Cd), lo cual es coherente con informes que indican que el Cd induce la síntesis de prolina en varias plantas, incluidos los cotiledones de rábano ( Biteur, 2012 ). Se ha observado una acumulación similar de prolina en respuesta a otros metales pesados, como el Cd en cacahuates ( Anuradha y Rao, 2007 ) y el Cu en arroz y zanahorias ( Chen et al ., 2004 ; Szafrariska et al ., 2011 ).
Nuestros resultados indican que la exposición al Cd y al Cu inhibió significativamente la actividad de la α-amilasa, aunque el tratamiento con una concentración específica de la mezcla Cu/Cd estimuló la enzima. Estos hallazgos coinciden con los de Mihoub et al . (2005) , quienes reportaron una disminución notable de la actividad amilolítica en presencia de dichos metales. La inhibición observada puede deberse a interacciones directas de Cd y Cu con α-amilasa o sus proteínas reguladoras, lo que dificulta la movilización de carbohidratos durante la germinación.
Además, el contenido de ADN en cotiledones de Lotus ornithopodioïdes L. disminuyó bajo estrés por metales, lo que indica una mayor sensibilidad a los metales pesados. Esta observación coincide con estudios previos que reportaron un contenido reducido de ADN en plantas como la mostaza y el frijol expuestas a metales pesados en condiciones salinas ( Chatterjee et al ., 1985 ; Bouzid, 2009 ). Niveles bajos de ADN sugieren un desarrollo celular y una síntesis de proteínas afectados, fundamentales para el crecimiento de las plantas y la tolerancia al estrés ( Bouzid, 2009 ).
La inoculación con Bradyrhizobium sp. ( Lotus ) condujo a una reducción significativa de los aminoácidos totales, de la prolina y de los azúcares solubles en presencia de iones de cobre y de cadmio. Esto contrasta con los hallazgos previos de Silini et al . (2016) , quienes reportaron un aumento de los osmoprotectores en semillas de trigo tras la inoculación con Azotobacter bajo estrés abiótico.
La presencia de cadmio (Cd) y cobre (Cu) afectó negativamente la germinación y varios parámetros bioquímicos; sin embargo, las semillas inoculadas mostraron un mejor desempeño en comparación con los controles no inoculados. Específicamente, la inoculación condujo a una reducción de los niveles de prolina y de aminoácidos, al tiempo que promovió una mayor actividad de la α-amilasa y un mayor contenido de ADN, lo que indica una respuesta metabólica más robusta al estrés por metales.
Estos hallazgos sugieren que Bradyrhizobium sp. ( Lotus ) desempeña un papel fundamental en la mitigación de los efectos negativos de los metales pesados en la germinación y el crecimiento de las plantas. Los mecanismos por los cuales esta bacteria mejora la resiliencia pueden implicar la modulación de osmoprotectores y de actividades enzimáticas, las cuales son esenciales para mantener la homeostasis celular bajo condiciones de estrés. En general, esta investigación destaca el potencial de utilizar Bradyrhizobium sp. ( Lotus ) como herramienta biotecnológica en la agricultura sostenible para mejorar la resiliencia de los cultivos en ambientes contaminados con metales.
Esta investigación fue financiada por la Direction Générale de la Recherche Scientifique et du Développement Technologique (DGRSDT) y el CRAPast, Argelia.
Los autores extienden sus agradecimientos a la Direction Générale de la Recherche Scientifique et du Développement Technologique (DGRSDT), Argelia.
Babu, P.; Bryan, J. D.; Panek, H. R.; Jordan, S. L.; Forbrich, B. M.; Kelley, S. C.; Colvin, R. T. and Robinson, L. C. 2002. Plasma membrane localization of the Yck2p yeast casein kinase 1 isoform requires the C-terminal extension and secretory pathway function. J. Cell Sci. 115(24):4957-4968. https://doi.org/10.1242/jcs.00203.
Etesami, H. and Maheshwari, D. K. 2018. Use of plant growth promoting rhizobacteria (PGPRs) with multiple plant growth promoting traits in stress agriculture: action mechanisms and future prospects. Ecotoxicology and Environmental Safety. 156(1):225-246. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2018.03.013.
Hossain, M. A.; Piyatida, P.; da Silva, J. A. T. and Fujita, M. 2012. Molecular mechanism of heavy metal toxicity and tolerance in plants: central role of glutathione in detoxification of reactive oxygen species and methylglyoxal and in heavy metal chelation. Journal of Botany. 1:1-37. https://doi.org/10.1155/2012/872875.
Szafrariska, K.; Cvikrovsk, M.; Kowalska, U.; Gdrecki, R.; Martincova, I. and Janas, K. M. 2011. Influence of copper ions on growth, lipid peroxidation, proline and polyamines content in carrot rosettes obtained from another culture. Acta Physiol. Plant. 33(3):851-859. https://doi.org/10.1007/s11738-010-0610-y.