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Las enfermedades representan una de las principales causas de pérdida en la producción agrícola. Aunque los productos químicos son una alternativa común para su control, generan efectos negativos en la salud humana y el ambiente. Por ello, se requieren opciones sustentables como el uso de microorganismos del suelo con actividad biocontroladora, como Trichoderma, hongo que presenta múltiples mecanismos de acción contra fitopatógenos, estimula la microbiota del suelo, mejora la absorción de nutrientes y activa los mecanismos de defensa de las plantas. El objetivo de esta investigación fue evaluar el antagonismo de once especies autóctonas de Trichoderma frente a Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani y Sclerotinia sclerotiorum, mediante el porcentaje de inhibición del crecimiento radial, porcentaje del área de crecimiento, grado de antagonismo y presencia de micoparasitismo. Se realizó confrontación dual en condiciones in vitro en el laboratorio de fitopatología de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma del Estado de México. Los aislamientos Trichoderma atroviride TH3 y T. asperellum Th11 destacaron por su capacidad de inhibición, reducción del crecimiento patógeno, alto grado de antagonismo y micoparasitismo. El grado de antagonismo fue evaluado con cobertura de hasta dos tercios del área de crecimiento sobre el patógeno. Rhizoctonia solani mostró el menor porcentaje del área de crecimiento y fue el principal blanco del micoparasitismo. Los resultados sugieren que las especies de Trichoderma tienen potencial para ser utilizadas en prácticas agrícolas sostenibles.
antagonismo, área de crecimiento, inhibición, micoparasitismo, patógenos, Trichoderma.
Existe un grave riesgo de pérdidas económicas en la producción agrícola, así como un gran desafío para la seguridad alimentaria, debido al impacto significativo de las plagas, las cuales provocan pérdidas globales de entre el 17.2% y 21.5% en cultivos como trigo, arroz, maíz, papa y soya (Savary et al., 2019; Skendžić et al., 2021). El uso masivo de productos fitosanitarios en el control de plagas ha generado consecuencias negativas, como la pérdida de biodiversidad, el desarrollo de resistencia por parte de los organismos plaga y daños a la salud humana (Vinchira-Villarraga y Moreno-Sarmiento, 2019).
En respuesta a ello, se han buscado alternativas más sostenibles, entre las que destaca el uso de microorganismos antagónicos, considerados como opción viable para asegurar la producción de alimentos sanos (Gutiérrez-Ramírez et al., 2013; Companioni et al., 2019; Vinchira-Villarraga y Moreno-Sarmiento, 2019). Los microorganismos con actividad biocontroladora presentan características de crecimiento rápido, alta capacidad reproductiva, eficiencia competitiva y adaptación al ambiente (Viera-Arroyo et al., 2020).
Actualmente, existe un amplio número de microorganismos con aplicaciones rentables en agricultura como agentes de control, destacando Trichoderma spp., hongo cosmopolita con alta presencia de competencia por espacio y nutrientes, así como producción de metabolitos bioactivos (Amerio et al., 2020; Andrade-Hoyos et al., 2023; Cortés-Hernández et al., 2023). Se han descrito más de 200 especies del género Trichoderma, como agentes de control biológico (Garrido et al., 2019; Sood et al., 2020; Allende-Molar et al., 2022). En México se han reportado 42 especies, siendo las más comunes T. asperellum y T. viride (Allende-Molar et al., 2022).
Especies como T. asperellum, T. atroviride, T. hamatum, T. harzianum, T. longibrachiatum, T. koningii y T. viride, entre otras, han mostrado efectos de antagonismo y micoparasito contra fitopatógenos del suelo como Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Phymatotrichopsis omnivora (Andrade-Hoyos et al., 2019; Camacho-Luna et al., 2021; Allende-Molar et al., 2022). Otras especies actúan sobre los patógenos debido a la presencia de diversos metabolitos secundarios (Montes-Vergara et al., 2022).
En el área biotecnológica las especies de Trichoderma son de interés por la producción de enzimas, generosamente utilizadas en la industria alimentaria (Allende-Molar et al., 2022), además otras especies se reportan como bioinductoras del crecimiento vegetal (Hernández-Melchor et al., 2019; Matas-Baca et al., 2023) y responsables de activar la respuesta sistémica en plantas mediante la expresión de genes como Epl1 y Sm1 (Martínez-Canto et al., 2021).
Aunque existen numerosos estudios sobre el control biológico de patógenos mediante Trichoderma spp., es necesario implementar estudio de cepas autóctonas, adaptadas a las condiciones ambientales locales (Amerio et al., 2020). El objetivo de esta investigación fue evaluar la actividad de antagonismo de once especies autóctonas de Trichoderma frente a los fitopatógenos Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani y Sclerotinia sclerotiorum en condiciones in vitro.
Las cepas fúngicas empleadas en este estudio pertenecen a la colección del Laboratorio de Fitopatología de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma del Estado de México. Los patógenos utilizados fueron: Botrytis cinerea (fresa), Fusarium oxysporum (aguacate), Rhizoctonia solani (papa) y Sclerotinia sclerotiorum (girasol). Las cepas antagonistas de Trichoderma spp., fueron colectadas en distintas regiones del Estado de México durante el año 2023, a partir de muestras de rizosfera de diversos cultivos agrícolas e identificadas molecularmente en el año 2024 (en proceso de publicación).
Las cepas de patógenos y antagonistas se activaron en medio PDA BD Difco™ (agar papa dextrosa) durante siete días a 25 °C, empleando el mismo medio para las siembras duales. Los ensayos de confrontación consistieron en la siembra dual antagonista-patógeno, siguiendo la metodología de Dennis y Webster (1971). Para ello, se colocó un disco de micelio de 7 mm de crecimiento micelial del patógeno, al margen interno de la placa de Petri con medio de cultivo, en el extremo opuesto, se sembró el antagonista.
El testigo consistió en la siembra única del patógeno al margen de la placa de Petri. Las placas de Petri se incubaron a 25 °C durante diez días en oscuridad, hasta que los micelios hicieron contacto y el testigo colonizó completamente la placa de Petri. Se calcularon los valores medios del porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) del micelio, de acuerdo con la fórmula: PICR= [(R1 - R2) / R1] × 100 (Ezziyyani et al., 2004). Donde: PICR= porcentaje de inhibición del crecimiento radial del micelio (mm); R1= crecimiento micelial del patógeno (testigo); R2= crecimiento micelial del patógeno en confrontación con el antagonista.
El experimento se realizó bajo un diseño completamente al azar con tres repeticiones por patógeno en siembra dual con once especies de Trichoderma.
El porcentaje del área de crecimiento del patógeno por efecto del antagonista en la siembra dual se estimó mediante la aplicación tecnológica AutoCAD®, de uso en ingeniería y arquitectura (Khoroshko, 2020). Este software permite estimar áreas, utilizando comandos dinámicos, lo cual es útil con formas circulares o irregulares, como en el caso del crecimiento fúngico.
El grado de antagonismo de Trichoderma se determinó mediante la escala de Bell et al. (1982), la cual describe la capacidad de colonización del antagonista en la superficie del medio de cultivo en siembra dual con el patógeno, bajo cinco niveles, que miden la supremacía del antagonista hasta su ausencia.
Se emplearon preparaciones semi permanentes teñidas con azul de lactofenol (Corrales et al., 2020) a partir de cultivos duales de 10 días de edad. Estas muestras se observaron al microscopio óptico con aumentos de 40X y 100X. Se examinaron 10 campos de cada muestra para determinar la presencia de micoparasitismo, siguiendo la metodología descrita por Andrade-Hoyos et al. (2019), con modificaciones. Se consideró la presencia de micoparasitismo cuando se observó el enrollamiento de hifas por parte del antagonista y la deformación o fragmentación del micelio del patógeno.
Los resultados de PICR y PAC se transformaron mediante la función arcoseno, seguidos de un análisis de varianza (Anova) y una comparación múltiple de medias con la prueba de Tukey (p ≤ 0.05), bajo un diseño completamente al azar con tres repeticiones. El análisis estadístico se realizó utilizando el programa InfoStat, versión 2020.
El porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) evaluado en siembra dual con las once especies autóctonas de Trichoderma y los fitopatógenos Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani y Sclerotinia sclerotiorum mostraron inhibición del crecimiento micelial con diferencias significativas (p ≤ 0.05) respecto al testigo, (Cuadro 1).
Los aislamientos que mostraron mayor actividad inhibitoria contra los patógenos fueron: T. atroviride Th3 (57.46%), T. scalesiae Th9 (57.31%) y T. atroviride Th1 (57.22%). En cuanto a los patógenos más afectados en su desarrollo micelial por efecto del antagonista fueron B. cinerea (59.32%), F. oxysporum (55.88%) y R. solani (52.67%), mientras que el menor nivel de control se observó en S. sclerotiorum (47.41%).
De acuerdo con Matas-Baca et al. (2023), el uso de especies autóctonas con actividad antagonista natural resulta altamente eficiente en el control de diversos fitopatógenos y su uso es reconocido en planes de agricultura sostenible (Companioni et al., 2019; Cortés-Hernández et al., 2023). Las especies de Trichoderma consideradas en este estudio presentaron actividad de biocontrol contra fitopatógenos del suelo, al igual y como lo señalan Yao et al. (2023), con T. viride y T. harzianum en la limitación del crecimiento de 29 especies de hongos fitopatógenos, entre los que destacan Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani y Sclerotinia sclerotiorum.
Los aislamientos de Trichoderma en la inhibición de los patógenos, varía dependiendo de la cepa autóctona y de la especie de fitopatógeno empleado. En este estudio, la respuesta del PICR de T. atroviride Th3 sobre el patógeno Rhizoctonia solani fue de 57.51%, superando lo reportado por Pérez et al. (2020) para esta misma especie. De igual forma, Geng et al. (2022) destacan una inhibición significativa del 68% y un rápido desarrollo de T. harzianum sobre B. cinerea en cultivo dual in vitro, porcentaje comparable con los aislamientos autóctonos T. scalesiae Th9 (65.02%) y T. atroviride Th2 (64.98%), (Figura 1).
A) B. cinerea en confrontación con T. scalesiae; B) F. oxysporum en confrontación con T. atroviride; C) R. solani en confrontación con T. asperellum; D) S. sclerotiorum en confrontación con T. scalesiae. E) enrollamiento de Trichoderma atroviride sobre Rhizoctonia solani; F) Trichoderma atroviride invade el micelio de Rhizoctonia solani.
Por otro lado, Silva et al. (2022) reportan un 12.2% de inhibición del crecimiento de S. sclerotiorum al emplear T. lentiforme, en contraste T. hamatum Th6 y T. atroviride Th10, cuadruplicaron dicho porcentaje, alcanzando valores de PICR de 51.45% y 51.19%, respectivamente. En cuanto a F. oxysporum, Sallam et al. (2019) informan alto PICR utilizando T. atroviride como antagonista, resultado que concuerda con los hallazgos de este estudio. El análisis de varianza indicó un efecto significativo de los tratamientos con diferentes especies autóctonas de Trichoderma sobre el PICR de los distintos patógenos, con un coeficiente de determinación R2= 0.98. Asimismo, la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (p ≤ 0.05) identificó diferencias significativas entre los aislamientos, agrupándolos en distintos niveles de efectividad antifúngica.
El porcentaje de área de crecimiento (PAC) de los hongos fitopatógenos y su respectivo antagonista utilizando el software AutoCAD®, permitió medir el área (cm2) de la colonia de forma más eficiente, que con métodos manuales (Khoroshko, 2020). El patógeno con menor PAC fue Rhizoctonia solani (9.54%) y el mayor por Fusarium oxysporum (16.95%), mostrando diferencias significativas entre los aislamientos (Tukey (p ≤ 0.05) como se describe en el Cuadro 2.
La necesidad de estimar el porcentaje de área de crecimiento de los hongos en estudios de inhibición lo confirma Camacho-Luna et al. (2021), quienes evaluaron la acción de Trichoderma sp., sobre el porcentaje de área de crecimiento de Fusarium oxysporum y F. proliferatum, alcanzando valores de 20.4% y 33.3%. En contraste, los resultados obtenidos en este estudio mostraron PAC que oscilaron entre 10.9% y 12.9%. Estos resultados resaltan el empleo de herramientas computacionales en la estimación de áreas en fenómenos biológicos, permitiendo obtener datos precisos y cuantificables.
Los atributos que se reconocen a Trichoderma en el éxito de antagonista incluyen su capacidad para competir por espacio y nutrientes, rápido desarrollo y habilidad de micoparásito (Martínez-Martínez, 2020). En general, los resultados mostraron que las especies autóctonas de Trichoderma alcanzaron el grado 2, sobre los patógenos evaluados, lo cual representa la colonización de dos tercios del medio de cultivo, limitando el crecimiento de los fitopatógenos. Este comportamiento fue particularmente evidente frente a Botrytis cinerea y Fusarium oxysporum.
En contraste, las cepas Trichoderma viridarium TH4 y Trichoderma viride TH5 manifestaron baja actividad antagónica contra Rhizoctonia solani, al presentar un grado 3, que indicó competencia entre ambos organismos; mientras que para Sclerotinia sclerotiorum se observó grado 3 y 4 respectivamente, reflejando una limitada efectividad del antagonista. No obstante, Rodríguez y Flores (2018) reportaron valores de 1 a 3 empleando T. harzianum frente a Rhizoctonia solani.
El género Trichoderma se ha reconocido con actividad de micoparasitismo, definido como la capacidad de actuar sobre la pared celular del huésped (Matas-Baca et al., 2023). En este estudio fue posible documentar el tipo de micoparasitismo efectuado por cepas autóctonas de Trichoderma sobre el patógeno Rhizoctonia solani, debido a que presenta un micelio grueso y de coloración oscura que contrastó con el antagonista. Las especies de Trichoderma que mostraron micelio enrollado sobre el patógeno fueron Trichoderma atroviride Th2 y Trichoderma viride Th5; aquellas con micelio invadiendo internamente al patógeno fueron T. atroviride Th3, Trichoderma scalesiae Th9 y Trichoderma asperellum Th11; mientras que las cepas que fragmentaron el micelio del patógeno fueron T. atroviride Th7 y T. atroviride Th10 (Figura 1).
Se ha documentado que, tras la penetración exitosa, Trichoderma es capaz de degradar la pared celular de su huésped mediante la producción de enzimas sobre distintas especies de patógenos, incluso puede localizarse en el lumen del hongo, una vez que ha penetrado en su interior (Sood et al., 2020). Por su parte, Tyskiewicz et al. (2022) reconocen la acción de Trichoderma spp. mediante la degradación de la pared celular de los hongos. En este sentido Fernández (2022) relata la iniciación parasitaria con la activación de genes de reconocimiento, seguido del enrollamiento y finalmente la desintegración de las hifas.
Se confirma el potencial de las especies autóctonas de Trichoderma spp., como agentes de biocontrol contra los fitopatógenos Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani y Sclerotinia sclerotiorum, dadas sus características de PICR, PAC, GA y micoparasitismo, destacando los aislamientos Trichoderma atroviride Th3 y Trichoderma asperellum Th11. La actividad micoparasítica de Trichoderma fue sobresaliente con Rhizoctonia solani, incluyendo el enrollamiento del micelio, la penetración en el patógeno y la degradación de su pared celular.
Finalmente, este estudio aportó al conocimiento sobre el uso de Trichoderma spp., autóctonas en el control de patógenos en cultivos in vitro, brindando información valiosa para sus futuras aplicaciones en programas de manejo de enfermedades.
La investigación recibió apoyo del Fondo Comecyt, Edomex-Ficdtem-2022-01: financiamiento para investigación de mujeres científicas. Proyecto: FICDTEM-2023-115.
Andrade-Hoyos, P.; Luna-Cruz, A.; Osorio-Hernández, E.; Molina-Gayosso, E.; Landeros-Valenzuela, N. y Barrales-Cureño, H. J. 2019. Antagonismo de Trichoderma spp. vs hongos asociados a la marchitez de chile. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas. 10(6):1259-1272. https://doi.org/10.29312/remexca.v10i6.1326.
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