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El café en México es importante para la economía, generando empleos y divisas; no obstante, enfrenta problemas fitosanitarios como la antracnosis, causada por el hongo Colletotrichum sp., la cual, se maneja a través de productos químicos, afectando al medio ambiente, por lo que se hace necesario buscar alternativas más amigables para el control de esta enfermedad. El objetivo de la investigación fue evaluar el efecto antagonista de tres microorganismos (Trichoderma sp., Bacillus sp. y Verticillium sp.) frente a Colletotrichum sp., en muestras colectadas en los municipios de Temascaltepec y Tejupilco, Estado de México en diferentes fechas del año 2024. El experimento se realizó en el laboratorio de Fitopatología del Instituto de Investigación y Capacitación Agropecuaria, Acuícola y Forestal del Estado de México. Se realizó la confrontación In vitro de las cepas antagónicas frente a Colletotrichum sp., calculando con el software ImagenJ: a) grado de micoparasitismo y b) porcentaje de inhibición de crecimiento. Para determinar el modo de acción del antagonismo, se realizó un Anova y una comparación de medias de Tukey (p> 0.05). Se observó que Trichoderma sp., presentó el mayor grado de inhibición sobre el fitopatógeno con 85.15%, Bacillus sp., con 59.27% y Verticillium sp., con 47.08%. Se concluyó que Trichoderma sp., fue el microorganismo que tiene el mayor efecto antagonista, lo que sugirió la viabilidad de realizar investigaciones en campo, para evaluar el impacto de este microorganismo en el control de la enfermedad en condiciones naturales.
Bacillus sp., Colletotrichum sp., Trichoderma sp., Verticillium sp.
Actualmente, el café es un producto de alto valor comercial. En México, los principales estados productores son Chiapas, Veracruz, Oaxaca y Jalisco. No obstante, el Estado de México también contribuyó a la producción nacional, en el año 2021 se reportaron 530.81 ha sembradas, con una producción de 639.89 t y un rendimiento promedio de 1.21 t ha-1 (Bastos-Osorio et al., 2019; SIACOM, 2022).
El cultivo de café enfrenta problemas fitosanitarios, como la antracnosis causada por el hongo Colletotrichum sp., entre los que se han reportado Colletotrichum kahawae y Colletotrichum gloeosporioides, que afectan diversas partes de la planta (Cannon et al., 2012). El desarrollo de la enfermedad se ve influenciado por factores bióticos, como la esporulación de los hongos y los vectores de transmisión, así como factores abióticos, como la temperatura, la alta humedad relativa, el viento y la lluvia (Rojo-Bi et al., 2017).
Tradicionalmente se controla con fungicidas de alta toxicidad de uso restringido como benzimidazol y estrobilurinas, azoxystrobin, clorotalonil, mancozeb y tiabenzadol, de ahí la importancia de buscar alternativas de producción del cultivo más inocua (Rojo-Bí et al., 2017; Sood et al., 2020). Una de las alternativas más prometedoras es el uso de microorganismos como agentes de control biológico. Trichoderma sp., mostró un alto potencial como antagonista de fitopatógenos incluyendo Fusarium sp., Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Phytophthora sp. y Pythium sp., entre otros en distintos cultivares de valor comercial (Martínez y Coca, 2020; García-Velasco et al., 2021).
Por otra parte, Bacillus sp., produjo una gran variedad de antibióticos como lipopeptidos, que inhiben el crecimiento de patógenos como Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Xanthomonas sp. y Botrytis cinérea (Astorga-Quirós et al., 2014; Pérez y García, 2019; Zuñiga et al., 2019). Asimismo, Verticillium sp., demostró un gran potencial como biocontrolador del mildiú polvoroso en pepino, produciendo estructuras de resistencia llamadas dictioclamidiosporas (Aiavo, 2015; Espinoza et al., 2017).
El objetivo de la investigación fue evaluar el efecto antagonista de tres microorganismos (Trichoderma sp., Bacillus sp. y Verticillium sp.) frente a Colletotrichum spp., en muestras colectadas en los municipios de Temascaltepec y Tejupilco, Estado de México en diferentes fechas del año 2024.
El estudio se llevó acabó en la zona productora de café del Estado de México, en el municipio de Temascaltepec (19° 02’ 35’’ latitud norte 100° 02’ 29’’ longitud oeste, altitud media de 1 719 m) y Tejupilco (18° 48’ 47’’ latitud norte 100° 08’ 06’’ longitud oeste, altitud media de 1 043 m). Se recolectaron muestras de hojas y frutos de café con síntomas de antracnosis (SENASICA, 2014) y fueron trasladadas al Laboratorio de Fitopatología del Instituto de Investigación y Capacitación Agropecuaria, Acuícola y Forestal (ICAMEX), en donde se desarrolló la investigación (García-Velasco et al., 2021) (Figura 1).
Para realizar el aislamiento se implementó la metodología utilizada por Rengifo et al. (2002); Guzmán y Rivillas (2005), con algunas modificaciones. Las hojas con la presencia del patógeno se lavaron con agua corriente, las láminas foliares se sumergieron en ADE (agua destilada estéril) por cinco minutos y posteriormente se enjuagaron con abundante ADE. Se colocaron en cajas Petri, simulando una cámara húmeda en completa oscuridad a 26 °C y con el 100% de humedad relativa, en una incubadora Heratherm Thermo Scientific, revisándose a las 24 y 48 h. Con una cámara de flujo laminar y un estereoscopio marca Labomed, se identificaron masas de conidios dentro de los acérvulos; con el microscopio marca Labomed USA, con los lentes 10 x y 40 x se identificaron conidios de Colletotrichum sp., sobre las lesiones, estos se transfirieron a 12 cajas Petri que contenían 20 ml de PDA estéril y se monitoreó el crecimiento del patógeno durante seis días, seleccionando las colonias puras para realizar el antagonismo (SENASICA, 2014; Ruíz-Campos, 2022).
El antagonismo, se realizó según lo propuesto por Suárez et al. (2008), en donde se utilizó agar papa dextrosa (PDA) en caja Petri, colocando en un extremo de la caja un disco de agar de cinco mm de diámetro con el micelio del patógeno Colletotrichum sp. y en el extremo opuesto, otro disco con el micelio de los antagonistas, manteniendo una distancia aproximada de 5 cm entre ambos.
El área de crecimiento de las colonias se determinó a partir de las imágenes procesadas mediante el software Imagej, con el fin de evaluar la capacidad antagónica de los biocontroladores. A partir de estas mediciones, se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento (PIC), para comparar el crecimiento del patógeno en presencia del antagonista con respecto al testigo. La fórmula utilizada descrita por Quintana-Obregón et al. (2010); Araya et al. (2019) se expresó de la siguiente manera:
Donde: R1 crecimiento del testigo; R2 crecimiento del patógeno en antagonismo, expresado en porcentaje. Para evaluar el grado de micoparasitismo, se utilizó la escala propuesta por Astorga-Quiroz et al. (2014) (Cuadro 1).
El antagonismo con los microorganismos se realizó mediante un diseño completamente al azar con tres tratamientos: a) Antagonismo- Colletotrichum-Trichoderma (ACT); b) Antagonismo- Colletotrichum-Bacillus (ACB) y c) Antagonismo- Colletotrichum- Verticillium (ACV), además de un grupo testigo, con cinco repeticiones por tratamiento, utilizando como unidad experimental una caja Petri, para la comparación entre tratamientos, se realizó una prueba de Tukey (p = 0.05) y se usaron las pruebas de Shapiro-Wilk y Levene para validar normalidad y homocedasticidad, respectively. También se aplicó una prueba de Kruskal-Wallis. El análisis estadístico se realizó con el software InfoStat 2020; (Suárez et al., 2008; Astorga-Quirós et al., 2014).
El aislamiento e identificación del patógeno se realizó con las muestras de hojas de café con los síntomas de Colletotrichum sp. (Figura 2A). Se obtuvieron tres aislamientos C1, C2 y C3, los cuales crecieron rápidamente en la incubadora a una temperatura de 26 ±1 °C, cubriendo en su totalidad la caja Petri al sexto día.
Las colonias presentaron un aspecto algodonoso, blanco grisáceo, con masas de acérvulos anaranjados y una base de color rojo cobrizo (Figura 2B). La descripción morfológica coincide con la reportada por Ruíz-Campos (2022), quien identificó especies de Colletotrichum sp., mediante técnicas morfológicas y moleculares. Las observaciones microscópicas, con los lentes 10 x y 40 x mostraron que las colonias presentaban: micelio hialino, conidios unicelulares alargados con extremos redondeados y un crecimiento radial y algodonoso (Figura 2C), características descritas también por Hyde et al. (2009). En cuanto al crecimiento de las colonias, Domínguez-Guerrero et al. (2012), reportó un crecimiento radial o en círculos concéntricos, aéreo algodonoso, mientras que las setas son raramente observadas.
Una vez que se aisló e identifico al patógeno, se procedió a realizar las pruebas antagónicas, mediante las cuales se analizó el porcentaje de inhibición de crecimiento. Este análisis se llevó a cabo en el segundo, cuarto y sexto día después de establecer el experimento de antagonismo en el laboratorio. El tratamiento ACT identificado como Trichoderma sp., fue el más efectivo en controlar el crecimiento micelial de Colletotrichum sp. con un PIC de 17.09% ±8.25 en el segundo día, 79.03% ±8.55 en el cuarto día y 85.15% ±1.34 en el sexto día (Figura 3A).
Este efecto se atribuyó a que el modo de acción de Trichoderma sp., es la competencia por espacio y nutrientes, micoparasitismo, es el principal mecanismo de acción la antibiosis (Martínez y Coca, 2020). Por su parte Sanmartín et al. (2012) obtuvo porcentajes de Inhibición de crecimiento, con cepas de T. asperellum contra C. gloeosporioides que variaron desde el 42.4% hasta el 66.8%, evaluándose con un alto grado de antagonismo.
Por otra parte, Zuñiga et al. (2019), obtuvieron un PIC del 31% con el medio de cultivo PDA con una concentración de 450 µg ml-1 de metabolitos secundarios extraídos con esporas de Trichoderma sp., se observaron cambios en el fenotipo de C. gloeosporioides tales como modificaciones en la textura, el color, un adelgazamiento del micelio y una menor producción de biomasa del fitopatógeno tras el tratamiento.
El antagonista Bacillus sp., mostró un PIC del 27.08% ±8.25 en el segundo día, 59.27% ±8.55 en el cuarto día y 47.02% ±1.34 en el sexto día (Figura 3B). Este efecto se puede atribuir al modo de acción de Bacillus sp., el cual incluyó la producción de compuestos antimicrobianos, enzimas líticas, competencia por nutrientes y espacio, así como la inducción de defensas en la planta huésped (Pérez y García, 2019). Estos valores dentro de los intervalos reportados por Amaro et al. (2018), quienes obtuvieron una reducción del crecimiento micelial del patógeno entre 48.75% y un 72.01%; asimismo, Zúñiga et al. (2019), reportaron una inhibición del crecimiento del 52% al emplear metabolitos secundarios de Bacillus subtilis, obtenidos mediante extractos hexánicos y acetato de etilo .
En cuanto a Verticillium sp., el PIC fue de 36.89% ±8.25 en el segundo día, 47.08% ±8.55 en el cuarto día y 39.48% ±1.34 en el sexto día (Figura 3C). Este comportamiento antagonista se debió a su capacidad para producir metabolitos antimicrobianos, competencia por nutrientes y espacio y parasitismo directo (Aiavo, 2015). Estos valores coinciden con los descrito por Bello et al. (2018) en su análisis observaron hasta un 82.6% de inhibición de pústulas de roya a los 65 días después de asperjar Verticillium sp., en campo, siendo este el porcentaje más alto registrado en el cultivo de café. Por su parte, Sharma et al. (2023) mencionaron que los híbridos recientes de Verticillium sp., generados por fusión de protoplastos, presentan mayor virulencia y un rango más amplio de hospedadores.
Respecto al Anova en el segundo día no hay un efecto estadísticamente significativo sobre el porcentaje de inhibición de crecimiento de Colletotrichum sp. entre los tratamientos (Cuadro 2), en el cuarto día, dado que F es de 7.31 y p< 0.05 existe una diferencia significativa entre los tratamientos, confirmando los datos en el análisis del día seis, en donde el valor de F es de 376.75 y el valor de p es de 0.0001, las variaciones en el PIC son mucho más claras y pronunciadas.
Estos datos se confirmaron con la prueba de comparación de medias de Tukey (p> 0.05) (Cuadro 3) y la prueba de Kruskal Wallis en donde se observó que los tratamientos empiezan a mostrar efectos diferentes a partir del cuarto día (Cuadro 2), estos valores coinciden con Sanmartín et al. (2012); Sharma et al. (2023).
Con respecto al grado de micoparasitismo, las pruebas de crecimiento en cultivo dual de Trichoderma sp. frente a Colletotrichum sp. (Cuadro 4) muestra una inhibición progresiva del crecimiento a partir del segundo día de incubación, Trichoderma sp., obtuvo un grado 4, que lo calificó con muy buen potencial biocontrolador.
| Antagonista | Contacto antagonista/patógeno (días) | Grado | Capacidad antagónica |
|---|---|---|---|
| Trichoderma sp. | 2 | 4 | Muy bueno |
| Bacillus sp. | 3 | 2 | Deficiente |
| Verticillium sp. | 5 | 1 | Malo |
Según Suárez et al. (2008), este hongo antagonista actúa por medio de una combinación de competencia por nutrientes, producción de metabolitos antifúngicos, enzimas hidrolíticas, micoparasitismo y producción de sustancias promotoras del crecimiento vegetal, esto también fue observado por Sanmartín et al. (2012), en donde calificó a T. asperellum en un grado antagónico cuatro, cubriendo totalmente a C. gloeosporioides a los 10 días, según la escala usada en los trabajos de Ezziyyani et al. (2004); Astorga-Quirós et al. (2014).
Por otra parte, Bacillus sp., frente a Colletotrichum sp. (Cuadro 4) mostró que el antagonista hizo contacto con el patógeno al tercer día mostrando una inhibición progresiva de su crecimiento, según la escala utilizada por Ezziyyani et al. (2004); Astorga-Quirós et al. (2014), Bacillus sp., obtuvo un grado 2, que lo calificó con una deficiente capacidad antagónica; sin embargo, Amaro et al. (2018), señalan que una vez que el antagonista hace contacto con el patógeno, produce una gran variedad de antibióticos que inhiben el crecimiento del patógeno por la competencia por espacio y nutrientes, no permitiendo el crecimiento de Colletotrichum sp.
En cuanto al hongo antagonista Verticillium sp., según la escala utilizada por Ezziyyani et al. (2004); Astorga-Quirós et al. (2014), obtuvo un grado 1 (Cuadro 4), lo cual se consideró malo. Esto debido a que el hongo antagonista hizo contacto con Colletotrichum sp. hasta el quinto día, invadiendo aproximadamente un cuarto de la superficie de la unidad experimental. Esto indica que la capacidad del hongo antagonista para inhibir el crecimiento del patógeno fue limitada, según Sood et al. (2020) mencionaron que la invasión parcial sugiere que la acción del antagonista no es suficiente para prevenir el crecimiento y desarrollo del patógeno.
Los tratamientos presentaron un alto efecto significativo en el PIC, el tratamiento ACT fue el que presentó el valor más alto alcanzó hasta 85.15% ±1.34, seguido de ACB con valores de hasta 59.27% ±8.55 y ACV sp., con valores de 47.08% ±1.34. Estos resultados mostraron que ACT es el tratamiento más efectivo en términos de inhibición del crecimiento de la colonia del patógeno. Por otra parte, Trichoderma sp., posiblemente actuó mediante micoparasitismo, competencia por espacio y nutrientes y antibiosis, sobre Colletotrichum sp., obtuvo un grado cuatro, debido a que invadió y destruyó las colonias del fitopatógeno, lo cual indicó que Trichoderma sp., presentó un alto potencial como biocontrolador en condiciones in vitro.
Domínguez-Guerrero, I. P.; Mohali-Castillo, S. R.; Marín-Montoya, M. A. y Pino-Menesini, H. B. 2012. Caracterización y variabilidad genética de Colletotrichum gloeosporioides sensu lato en plantaciones de palma aceitera (Elaeis guineensis) Jacq. en Venezuela. Tropical Plant Pathology. 37(2):108-122. https://doi.org/10.1590/S1982-56762012000200003.
Espinoza, A. E. E.; Guadalupe, C. S. A.; Gallegos, J. L. H.; Latorre, C. R. C. y Robalino, H. S. R. 2017. Análisis económico del control biológico de la araña roja (Tetranychus sp.) en el cultivo de la rosa a través de la aplicación del hongo entomopatogeno (Verticillium Lecanii). Ecuador. European Scientific Journal. 13:40-52. Doi: 10.19044/esj.2017.v13n13p240.
García-Velasco, R.; Alonso-Baena, A.; Domínguez-Arismendi, G.; Aguilar-Medel, S.; Mora-Herrera, M. E. y Companioni-González, B. 2021. Antagonismo in vitro de cepas nativas de Trichoderma spp. contra Verticillium dahliae y Botrytis cinerea en el Estado de México. Agronomía Tropical. 71:1-13. https://doi.org/10.5281/zenodo.5091830.
Quintana-Obregón, E. A.; Plascencia-Jatomea, M.; Sánchez-Mariñez, R. I.; Rosas-Burgos, E. C. y Cortez-Rocha, M. O. 2010. Inhibición del crecimiento radial in vitro de la Fusarium verticillioides en presencia de quitosano. Revista Iberoamericana de Polímeros. 11(6):386-391. https://www.researchgate.net/publication/269698958.
Suárez, M. C. L.; Fernández, B. R. J.; Valero, N. O.; Gámez, C. R. M. y Páez, R. A. R. 2008. Antagonismo in vitro de Trichoderma harzianum Rifai sobre Fusarium solani Mart. Sacc. Asociado a la marchitez en maracuyá. Revista Colombiana de Biotecnología. 10(2):35-43. https://www.redalyc.org/pdf/776/77610205.pdf.
Zúñiga, E. M.; Merlos, J. B.; Sánchez, B. C.; Pérez-Pérez, R. y Avilés, M. C. 2019. Evaluación de metabolitos antifúngicos obtenidos en medio PD mediante el cultivo y co-cultivo de Bacillus subtilis y Trichoderma spp. sobre el crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides y Fusarium oxysporum. Seguridad Alimentaria. 7-15 pp. https://www.researchgate.net/publication/332100019.