elocation-id: e3841
La bacteria Pseudomona viridiflava (Burkholder, 1930), causa daño económico en frijol (Phaseolus vulgaris L.), se ha demostrado que puede afectar a más de 50 huéspedes (Saygili et al., 2008), entre los que destacan: alfalfa (Medicago sativa), manzano (Malus pumila var. domestica (Borkh.) CK Schneid.), (Alimi et al., 2011), brócoli (Brassica oleracea L.), entre otros; sin embargo, Origanum vulgare, no hay reporte de algún daño sobre el agave mezcalero (Agave inaequidens K.Koch), una especie aun poco estudiada, en esta investigación se fundamentó en la evaluación de los efectos de la bacteria Pseudomona viridiflava en el proceso de imbibición en semilla de Agave inaequidens, mientras que por otra parte se evaluó la tolerancia de la bacteria a los aceites esenciales de canela (Cinnamomum verum Blume), clavo (Syzygium aromaticum L.) y orégano (Origanum heracleoticum Rchb.), como estudios preliminares para la estrategia de manejo ecológico, orgánico, libre de agroquímico en cultivos afectados por Pseudomona viridiflava, se encontró que la concentración del 25% de aceite de orégano y clavo, fueron eficientes en el desarrollo de la bacteria en condiciones in vitro, mientras que en el proceso de germinación en función a la imbibición de la semilla no hubo reducción en el porcentaje de germinación ni signos de daño por efecto de la bacteria.
Agave inaequidens, Agave mezcalero, Pseudomona viridiflava, control biológico.
La bacteria Pseudomona viridiflava (Burkholder 1930), es una especie gram negativa, con amplia gama de huéspedes, provoca síntomas en tallos, hojas y flores. Aunque es considerada una especie fitopatógena, tiene la capacidad de vivir como endófito, epifito y saprofito (Lipps y Samac, 2022). En México es de importancia en cultivos de hortalizas y frutos como: tomate (Solanum lycopersicum L.), (Jones et al., 1984), pimiento (Capsicum annum L.), melón (Cucumis melo L.), frijol (Phaseolus vulgaris L.), lechuga (Lactuca sativa L.), uva (Vitis vinifera L.) y cítricos (Beiki et al., 2016; Al-Karablieh et al., 2017).
La Pseudomona viridiflava pertenece al complejo de especies de Pseudomona syringae de importancia económica (Bartoli et al., 2015), esta bacteria forma colonias color blanco crema y la mayoría de las especies producen pigmento fluorescente en medio B de King (Aksoy et al., 2017). Los aislamientos son positivos a la pudrición blanda de papa y reacción de hipersensibilidad en tabaco, así como negativos para la producción de levan, oxidasa y actividad de arginina dehidrolasa, por lo que se considera perteneciente al grupo II de LOPAT (Levana-Oxidasa-Podredumbre de la papa-Arginina dihidrolasa- Hipersensibilidad en el Tabaco) (Lelliott et al., 1987; Tsuji y Fuji, 2021).
Se consideró a Pseudomona viridiflava como un patógeno con alto potencial para infectar a nuevos huéspedes (Ramírez et al., 2022), por lo tanto se ha registrado un aumento en nuevos huéspedes afectados por P. viridiflava, por tal motivo se consideró la evaluación de la patogenicidad en semillas y plántulas de Agave inaequidens, una especie utilizada para producción de mezcal artesanal, además la inflorescencia también se consume, así como la savia es empleada para bebidas fermentadas, como para uso medicinal se emplea el pulque y su inulina, además como diversas partes de la planta; sin embargo, es una especie con pocas investigaciones aún.
El Agave inaequidens es una especie nativa y se distribuye en Jalisco, Durango, Sinaloa, Hidalgo, Colima, Michoacán, Estado de México y Morelos en la República Mexicana, en una altura de 1 400 y 3 000 msnm (Torres et al., 2019).
Esta especie se encuentra amenazada por la excesiva extracción para la producción del mezcal. La amenaza más severa se localiza en el estado de Michoacán y sigue en aumento. Esta especie se encuentra en varias áreas protegidas como: Reserva de la Biosfera Sierra de Manantlán y Reserva de la Biosfera Mariposa Monarca (Torres et al., 2019); sin embargo, esto no demeritó la protección de la especie para evitar su extinción.
Por otra parte, para el control de las enfermedades ocasionadas por Pseudomona viridiflava se siguen empleando productos de naturaleza química como el polvo humectable de estreptomicina y oxitetraciclina más polvo humectable de validamicina A (Tae, 2019), riesgosos para la inocuidad alimentaria (Morris et al., 2019). El objetivo, fue caracterizar e identificar una cepa nacional de Pseudomona viridiflava, la posible patogenicidad sobre Agave inaequidens K. Koch, en la etapa de germinación de la semilla y la sensibilidad in vitro de la bacteria a aceites esenciales de canela (Cinnamomum verum J. Presl), clavo (Syzygium aromaticum) y orégano (Origanum vulgare L.), en concentraciones del 25, 50, 75 y 100%.
La presente investigación se realizó en el laboratorio de Virus Fitopatógenos del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, Texcoco, Estado de México.
La cepa de la bacteria Pseudomona viridiflava, es de origen mexicano (cepa nacional), se activó a partir de un tubo preservado en refrigeración, en medio de cultivo King B (KB) y se mantuvo en incubación en condiciones de obscuridad a temperatura de 27 °C ±1 °C.
El aislado se revisó en luz ultravioleta (25 W Transiluminador TFL-40, California, EE. UU), posteriormente se caracterizó por la prueba determinada Lopat (Lelliot y Stead, 1987) y según los protocolos descritos por Schaad et al. (2001).
Para la extracción de ADN, se utilizó CTAB 2%, para la identificación a nivel molecular, en un tubo Eppendorf® se colocaron 600 µl de buffer CTAB al 2% y posteriormente se introdujo una asada del cultivo bacteriano puro con un crecimiento de 24- 48 h en medio (KB). Se incubó a 56 °C por 30 min. Después, se añadieron 400 µl de Fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1), se pasó por vortex por 10 s y se centrifugó a 13 500 rpm por 10 min a 4 °C. De la fase acuosa se recuperaron 500 µl en un tubo nuevo y se adicionaron 50 µl de acetato de amonio al 7.5 M y 500 µl de isopropanol. La mezcla se realizó por inmersión. Se mantuvo en refrigeración a -20 °C por 1 h.
Se llevó la centrifuga a 13 500 rpm, 10 min a 4 °C, con precaución se desechó el sobrenadante, esta misma se lavó con 800 µl de etanol al 80% y se centrifugó 13 500 rpm por 3 min a 4 °C, se descartó nuevamente el etanol al 80% y se centrifugó a 13 000 rpm por 3 min a 4 °C, se descartó por segunda vez el etanol y se secó la pastilla por 30 min. Para finalizar, la pastilla se resuspendió en 50 µl de agua libre de nucleasas y se conservó a -20 °C. Los parámetros óptimos de concentración y pureza de ácidos nucleicos se evaluaron mediante espectrofotometría con la ayuda de un NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific 2000, EUA).
La identificación genómica se realizó mediante la amplificación del gen de ADN ribosómico 16S (ADNr), el cual generó un fragmento de 1 500 pb (Weisburg et al., 1991). En una muestra final de 10 µl integrada por: 2 µl Buffer PCR 1X, 0.8 µl de MgCl2 (50 Mm), 0.2 µl de dNTPs (10 mM), 0.2 µl de cada uno de los iniciadores FD1 (5’-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3´)/rP1 (3’ CCCGGGATCCAAGCTTACGGTTACCTTGTTACGACTT-5’), 0.1 µl de GoTaq® DNA Polimerase (Promega), 2 µl de ADN total (50 ng µl-1) y 4.7 µl agua libre de nucleasas. La PCR se realizó en termociclador MiniAmp™ (Thermo Fisher Scientific) y las condiciones de amplificación fueron: desnaturalización inicial a 95 °C por 2 min, 25 ciclos a 95 °C por 2 min, alineamiento a 42 °C por 30 s, extensión a 72 °C por 4 min y extensión final a 72 °C por 5 min. Los fragmentos amplificados se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.5% teñidos con bromuro de etidio y se visualizaron con luz UV en fotodocumentador.
Se realizó la Tinción de Gram y la prueba de KOH 3% (Arai, 2001). La prueba de oxidasa se realizó según lo descrito por Goszczynska et al. (2000). Para la determinación del metabolismo oxidativo/fermentativo se siguió la metodología señalada por Hugh y Leifson (1953). La reducción de nitratos a nitritos fue realizada como lo señalan (Hayward et al., 1991) y se tomó registro a los 3, 5 y 7 días. La producción de dihidrolasa de arginina se realizó según la propuesta por Thornley (1960). El registró de la hidrólisis de almidón, fosfatasa y levana se tomó después de 48 h. La licuefacción de gelatina se realizó de acuerdo con lo propuesto por Hayward (1994), mientras que la producción de indol se llevó a cabo tomando registro a los 3 y 5 días. Todas las pruebas se realizaron a 27 °C ±1 °C.
Se empleó exudado bacteriano de un cultivo puro, con un crecimiento de 48 h en medio (KB), a partir de este se realizó una suspensión a una densidad celular de 108 UFC/ml, a cuál se comparó con el estándar de McFarland. Con la ayuda de un émbolo de jeringa hipodérmica (3 ml), se infiltró la suspensión celular en el envés de la hoja de tabaco. Por medio de la infiltración se logró invadir los espacios intercelulares del mesófilo de la hoja, por lo que se observó la apariencia de humedad dentro de la lámina foliar. La inoculación se realizó bajo condiciones de laboratorio, con luz natural, humedad relativa baja y temperaturas promedio de 25 °C. Se evaluó el tejido colapsado a partir de las 24 h posteriores.
En una caja Petri, se colocó una sanita húmeda en el fondo de la caja Patri para posteriormente colocar dos rodajas de tubérculos de papa, con la ayuda de una aguja de disección estéril se tomó exudado bacteriano y se colocó en el centro de la rodaja de papa, realizando una incisión, en la otra rodaja se realizó la incisión, pero sin adicionar exudado bacteriano, se revisó a las 24 h posteriores.
La patogenicidad se evaluó en semillas de Agave inaequidens a diferentes tiempos de imbibición en 1 500 µl de una suspensión bacteriana al 108 UFC ml-1, (30 min, 2 h, 4 h, 6 h y 8 h). Se utilizaron 12 semillas por tratamiento y la misma cantidad de semillas en el tratamiento testigo por cada tiempo de imbibición, después del tiempo de imbibición las semillas se colocaron en cajas Petri duales, en la base se colocó una sanita húmeda con 3 ml de agua destilada estéril y se mantuvieron en condiciones de obscuridad en incubadora a una temperatura de 27 °C ±1 °C, hasta la aparición de la radícula, posteriormente se colocaron en condiciones de luz natural a temperatura ambiente.
En condiciones de asepsia, se utilizaron cajas de Petri de vidrio de dimensiones 180 x 30 mm, a las cuales se les adicionaron 50 ml de medio agar nutritivo sólido y se dejaron solidificar. Se preparó una suspensión bacteriana al 108 UFC ml-1, se agregaron 300 µl sobre el medio y se dispersó con asa bacteriológica plástica, se dejó que se impregnará la solución bacteriana al medio.
Posteriormente se colocaron cinco círculos de 0.5 mm de diámetro de papel filtro impregnados de los aceites esenciales de canela, clavo y orégano en concentraciones al 25, 50, 75 y 100%, con la ayuda de la formula Vi Ci= Vf Cf, (C= concentración; V= volumen; i= inicial; y f= final) (Cuadro 1). Los aceites se emulsificador con etanol al 25%. Cada caja Petri funcionó como un tratamiento con cinco repeticiones, se tomó el dato de desarrollo de los cuatro puntos cardinales de cada papel filtro.
Los datos se tomaron a las 48 h después de establecer el experimento y se analizaron en el paquete estadístico SAS versión 9.0, en un Anova completamente al azar con separación de medias de Tukey.
La caracterización fisiológica y bioquímica de la cepa nacional de Pseudomona viridiflava presentó alta similitud con el perfil metabólico descrito por Heydari et al. (2012); Sarris et al. (2012). Por medio de la prueba Lopat, la cepa nacional no produjo pigmentos fluorescentes en medio KB; sin embargo, indujo una reacción de hipersensibilidad en hojas de tabaco, presentó resultados negativos para oxidasa y arginina deshidrolasa, no produjo levana y generó maceración en las rodajas de tubérculos de papa (Harzallah et al., 2004). De acuerdo con Lelliot y Stead (1987), Pseudomona viridiflava pertenece al grupo II de Pseudomonas (Cuadro 2).
La lamina foliar de tabaco que fue infiltrado con la suspensión de la bacteria, presentó lesiones a partir de las 48 h posteriores a la inoculación.
Los tubérculos de papa evaluados presentan una pudrición a las 24 h posteriores a la inoculación, se observó la degradación del tejido vegetal, al tacto con la aguja de disección el tejido era blando y había necrosamiento, así como un avance en el proceso de oxidación natural del tejido.
Mediante la extracción de ADN de la bacteria en estudio, se pudo obtener la amplificación del Gen 16 S con 1 500 pb. Diversas investigaciones han considerado el riesgo de establecer filogenias basadas en secuencias de un solo gen; sin embargo, el Gen 16 S, es el más empleado para la identificación bacteriana (Lieckfeldt et al., 2000) (Figura 1).
Las semillas de Agave inaequidens que fueron imbibidas con la solución bacteriana a diversos tiempos, no redujeron su porcentaje de germinación por efecto del desarrollo de la bacteria Pseudomona viridiflava. Al tercer día de la imbibición de las semillas con la suspensión bacteriana, se empezaron a presentar las primeras semillas con la emergencia de la radícula; sin embargo, la mayoría se encontraban en la región de los testigos. Al día 12 se habían desarrollado el 96% de las plántulas de Agave inaequidens sin la presencia de daños ocasionados por la bacteria Pseudomona viridiflava (Figura 2). Por lo que se consideró que la bacteria no ejerce ningún efecto sobre el desarrollo germinativo de Agave inaequidens.
Los tratamientos de aceite de canela en su cuatro diferentes concentraciones presentaron diferencias estadísticas entre la dosis más alta (100%) la más baja (25%); sin embargo, un dato impórtate es que la dosis del 25% de concentración fue la más efectiva, pese a lo que se pensaría debido al grado de concentración del compuesto presente en el aceite, que son el cinamaldehído y eugenol; sin embargo, se destaca la importancia de que un aceite este emulsificado para que sea activado a una concentración menos densa para que se obtenga una mejor respuesta de control (Figura 3).
Los aceites esenciales prevenientes de plantas han mostrado tener propiedades antimicrobianas, antioxidantes, antiparasitarias, antiinflamatorias, antidiarreicas y antimicóticas en humanos (Van-Zyl et al., 2004). Estos resultados pueden estar asociados a la presencia de eugenol y cimaldehído en los aceites esenciales, que logran un efecto directamente sobre la membrana bacteriana inhibiendo el crecimiento de microorganismos fúngicos y bacterianos (Cava et al., 2012). Mientras que Tong et al. (2005), determinaron que los aceites esenciales pueden inhibir el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) del metabolismo de la respiración bacteriana, afectando el consumo de oxígeno de las bacterias, causando su muerte.
En los tratamientos de clavo a las dosis analizadas, estadísticamente se comportaron de forma similar entre ellas, el principal componente químico presente en su aceite fue el eugenol, compuesto antes mencionado en canela.
El aceite de orégano en las cuatro diferentes concentraciones logró el mayor radio de inhibición del desarrollo bacteriano, cabe señalar la capacidad de inhibición en la concentración más baja, lo que es un aporte importante al reducir los costos de aplicación en el caso particular que sea efectivo en condiciones in situ (Figura 4).
El uso de aceites esenciales de especies vegetales permite dar una alternativa positiva al uso de antibióticos que puedan generar resistencia y ser perjudiciales para la salud (Esquivel et al., 2010). Caballero et al. (2016), demostraron que los aceites esenciales de clavo de olor (Syzygium aromaticum) y canela (Cinnamomum zeylanicum) a concentraciones de 0.05, 0.1 y 0.2% inhiben el crecimiento de microorganismos fúngicos como Aspergillus flavus (Erosa et al., 2021), por lo cual en la presente investigación se sugiere la experimentación con otras dosis de los aceites para llegar a las concentraciones ideales.
Pseudomona viridiflava no generó patogenicidad en las semillas de Agave inaequidens, mientras que los aceites que provocaron una mayor inhibición del desarrollo de la bacteria fueron el orégano al 25%, seguido de la canela al 25% por lo que se consideran candidatos para ser evaluados en condiciones de invernadero y plantaciones a cielo abierto en los principales hospederos de la bacteria.
Al-Karablieh, N.; Mutlak, I. and Al-Dokh, A. 2017. Isolation and identification of Pseudomonas viridiflava, the causal agent of fruit rotting of Cucumis sativus. Jordan Journal of Agricultural Sciences. 13(1):79-91. https:// doi.org/10.12816/0039717.
Beiki, F.; Busquets, A.; Gomila, M.; Rahimian, H.; Lalucat, J. and García, V. E. 2016. The new Pseudomonas spp. is pathogenic to citrus. PLoS One. 11(2):1-16. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148796.
Caballero, C. A.; Villacorta, L. M. and Pretell, C. V. 2016. Efecto del aceite esencial de clavo de olor (Syzygium aromaticum), canela (Cinnamomum zeylanicum) y su combinación sobre la acción antifúngica en Aspergillus flavus en agar chicha de maíz (Zea mays L.), variedad morada. Pueblo Continente. 22(1):123-132.
Erosa, R. M. A.; Jiménez, M. J. M.; Ortiz, S. J. and Martínez, S. N. J. 2021. Efecto bactericida del aceite esencial de canela contra Salmonella spp. RD-ICUAP. 7(19):64-78. http://rd.buap.mx/ojs-dm/index.php/rdicuap/article/view/505.
Heydari, A.; Khodakaramian, G. and Zafari, D. 2012. Characterization of Pseudomonas viridiflava causing alfalfa root rot disease in Hamedan province of Iran. Journal of Plant Pathology and Microbiology. 3(5):130-135. https://doi.org/10.4172/2157-7471.1000135.
Lieckfeldt, E.; Cavignac, Y.; Fekete, C. and Börner, T. 2000. Endo-chitinase gene based phylogenetic analysis of Trichoderma. Microbiology Research. 155(1):1-9. https://doi.org/10.1016/S0944-5013(00)80016-6.
Thornley, M. J. 1960. The differentiation of other Gram-negative bacteria on the basis of arginine metabolism. Journal Applied Bacteriology. 23(1):37-52. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.1960.tb00178.x.