El material vegetal empleado consistió en hojas frescas de pirul, recolectadas de la región de Mineral de la Reforma, Hidalgo, México (coordenadas: 20.03948° latitud norte, -98.71728° longitud oeste). La identificación botánica de la especie se realizó utilizando claves taxonómicas y descripciones detalladas reportadas (Olvera et al., 2021). La recolección de las muestras se realizó en el mes de marzo de 2023, durante el periodo de crecimiento activo de la planta para asegurar la calidad y concentración óptima de los compuestos bioactivos.

Se seleccionaron hojas maduras y saludables, de la parte superior de las ramas para garantizar su frescura y el contenido óptimo de aceites esenciales. Las hojas presentaban un tamaño promedio de 6 cm de largo y 3-7 mm de ancho y coloración verde intensa, indicativa de su buena salud y contenido fitoquímico. La recolección se llevó a cabo utilizando tijeras de podar estériles para evitar la contaminación de las muestras.

Las hojas fueron colocadas en bolsas de papel para evitar la acumulación de humedad y transportadas a laboratorio en condiciones controladas, las cuales incluyeron mantener las muestras protegidas de la luz solar directa y a una temperatura ambiente constante (25 °C), asegurando que no se produjera degradación de los compuestos bioactivos durante el traslado. Se realizó la limpieza superficial con agua destilada para eliminar cualquier residuo de polvo o partículas externas.

Posteriormente, se secaron en un ambiente oscuro y ventilado a temperatura ambiente para evitar la degradación de los compuestos activos. Finalmente, las hojas se trituraron en trozos pequeños utilizando un mortero estéril, preparándolas para el proceso de extracción del aceite esencial mediante destilación por arrastre de vapor.

La extracción del aceite esencial se realizó utilizando el método de destilación por arrastre de vapor, mediante un equipo de destilación estándar con capacidad de 6 L, donde se utilizó 1.5 kg de hojas frescas de pirul previamente desinfectadas y trituradas para aumentar la superficie de contacto y facilitar la extracción, este procedimiento se realizó con cuatro repeticiones.

Se aplicó vapor a través de las hojas para volatilizar los compuestos esenciales durante 45 min, para posteriormente ser condensados y recolectados en forma de aceite esencial. El aceite esencial obtenido fue separado de los hidrolatos y almacenado en frascos opacos, a temperatura de 15 ±2 °C, para preservar su estabilidad y evitar la degradación de los compuestos bioactivos.

El rendimiento del aceite esencial se calculó como el porcentaje del peso de aceite obtenido respecto al peso inicial de las hojas utilizadas. Se registraron los datos de peso antes y después de la destilación para determinar el rendimiento. El análisis del aceite obtenido se llevó a cabo empleando un cromatógrafo de gases Agilent 7890B, equipado con una columna capilar de alta resolución de tipo DB-5MS (30 m × 0.25 mm × 0.25 µm).

Se aplicó un programa de temperatura que comenzó a 60 °C y aumentó a 250 °C a una tasa de 5 °C min^-1, con un flujo de gas portador (helio) de 1 ml min^-1. Los compuestos separados en la columna fueron detectados y caracterizados mediante espectrometría de masas en un espectrómetro Agilent 5977B, utilizando ionización por impacto electrónico (EI) a 70 eV. Los espectros obtenidos se compararon con la base de datos espectrométricas NIST 05 el sistema GC-MS (National Institute of Standards and Technology), para identificar los compuestos presentes en el aceite esencial, considerando aquellos con más de 5% de abundancia relativa.

Se prepararon placas de cultivo con medios de cultivo para cada patógeno bajo las condiciones descritas anteriormente de suspensión, incubación y concentraciones de aceite esencial. Posterior al período de incubación, se trató a las placas con una solución de MTT (2,5-difenil tetrazolio) o resazurina al 0.5% en solución salina estéril. La solución de MTT se añadió a cada placa y se incubaron a 37 °C durante 2 h.

Como controles se utilizaron los mencionados anteriormente. Para cuantificar la cantidad de formazán producido, se disolvió el precipitado en dimetilsulfóxido (DMSO) al 100% y se midió la absorbancia a 570 nm utilizando un lector de microplacas. Los valores de absorbancia obtenidos se compararon con los controles negativos (sin aceite esencial) y se utilizaron para calcular el porcentaje de viabilidad celular en función de la absorbancia.

Se realizó un análisis de varianza (Anova) de dos factores para evaluar el efecto de la concentración del aceite esencial y del tipo de patógeno sobre el diámetro del halo de inhibición. El modelo estadístico utilizado fue: diámetro del halo (mm) = μ + concentración + patógeno + concentración × patógeno + ε. Donde: μ es la media general y ε es el error experimental. Las interacciones entre concentración y patógeno se evaluaron para determinar efectos combinados.

Se utilizó la prueba de Tukey para realizar comparaciones múltiples entre las medias de los diámetros de los halos de inhibición de las diferentes concentraciones, identificando diferencias significativas (p≤ 0.05). Las letras diferentes indicaron diferencias significativas entre los grupos. El análisis de los datos obtenidos se realizó utilizando el software estadístico Sas versión 9.4.

Se utilizó un total de 1.5 kg de hojas secas para la extracción y el aceite esencial obtenido fue pesado para obtener su rendimiento, calculándolo con la siguiente fórmula:

Rendimiento % = Masa del aceite esencial (g) Masa del material vegetal seco (g) x100

El rendimiento del aceite esencial de S. molle fue del 0.5%, lo cual concuerda con los rendimientos reportados en la literatura, que típicamente varían entre 0.4% y 0.8% (Rey et al., 2018; Volpini et al., 2021).

La variabilidad en el rendimiento del aceite esencial puede atribuirse a varios factores, como condiciones ambientales durante el cultivo, el estado del material vegetal al momento de la cosecha y condiciones específicas de la extracción. Rey et al. (2018), reportan un rendimiento de aceite esencial de S. molle de 0.75% empleando destilación por arrastre de vapor de las hojas de la planta, mencionando que las condiciones climáticas y edáficas tienen un impacto significativo en la calidad y rendimiento del aceite.

Por su parte, en un estudio realizado por Lorenzo Volpini et al. (2021), el rendimiento del aceite esencial de que obtuvieron fue reportado como 0.6%, ligeramente superior al resultado obtenido en este estudio. El rendimiento del aceite esencial puede ser afectado por varios factores, siendo la calidad del material vegetal un factor crucial, hojas más frescas y saludables tienden a producir mayor rendimiento. Además, la técnica de destilación por arrastre de vapor puede tener variaciones en la eficiencia dependiendo de la configuración del equipo y los parámetros operativos (Božović et al., 2017).

El análisis GC-MS reveló que los principales compuestos en el aceite esencial de S. molle (Cuadro 1), incluyen α-pineno (5.2 min), β-pineno (6.3 min) y D-limoneno (7.8 min), los cuales son conocidos por sus propiedades antimicrobianas y antioxidantes. El α-Pineno y β-Pineno son terpenos que se encuentran comúnmente en los aceites esenciales de diversas plantas y tienen aplicaciones en la industria farmacéutica por sus efectos antiinflamatorios y antibacterianos (Guimarães et al., 2019).

Cuadro 1

Pico	Compuesto	Tiempo de retención (min)	Área relativa (%)	Masa molecular (g mol-1)
1	α-Pineno	5.2	15	136.24
2	β-Pineno	6.3	10.5	136.24
3	D-Limoneno	7.8	20.3	136.24
4	Cariofileno	10.1	12.7	204.34
5	P-Cimeno	12.3	8.9	134.22
6	Terpineol	14.5	7.8	154.24
7	Linalol	16.2	14.1	154.25
8	Eugenol	18.6	10.7	164.2

El D-limoneno, otro componente principal, también ha sido asociado con propiedades antimicrobianas y es utilizado en productos de limpieza y cosméticos debido a su aroma y capacidad para eliminar bacterias (Fisher y Phillips, 2008). El cariofileno, un sesquiterpeno identificado, se ha documentado por sus propiedades antiinflamatorias, lo que podría contribuir a efectos terapéuticos (Gertsch et al., 2008). Por su parte, el p-cimeno, el terpineol y el linalol, también presentes en el aceite, son conocidos por sus propiedades antimicrobianas y su uso en la industria alimentaria y cosmética (Burt, 2004).

Los compuestos identificados en el aceite esencial de S. molle en este estudio coinciden en gran medida con los perfiles reportados en la literatura. Según los autores mencionados, los aceites esenciales de S. molle contienen altos niveles de α-pineno y β-pineno, similares a los encontrados en este estudio. La presencia de eugenol, aunque menor en este estudio, también ha sido reportada en aceites esenciales de otras variedades de S. y está relacionada con propiedades antimicrobianas (Burt, 2004).

Los resultados de la prueba de difusión en disco indican que el aceite esencial de S. molle mostró una actividad antimicrobiana dosis-dependiente contra todos los patógenos evaluados. Los halos de inhibición aumentaron con la concentración del aceite esencial, con los mayores diámetros observados a 1 000 ppm. El análisis demostró que el aceite esencial inhibe el crecimiento micelial de los patógenos del maíz evaluados (Cuadro 2). La prueba de Tukey indicó diferencias significativas en los diámetros de los halos de inhibición para todas las concentraciones de aceite esencial comparadas con el control.

Cuadro 2

Concentración aceite S. molle (ppm)	Diámetro e inhibición del crecimiento miceliar (mm ± SD)
	Fusarium verticillioides	Aspergillus flavus	Ustilago maydis	Colletotrichum graminicola	Factor aceite (C)
0 (control)	9 ±0.5 a	9.1 ±0.3 a	8.9 ±0.4 a	9.1 ±0.5 a	9 ±0.1 A
50	8.5 ±0.5 ab	7.2 ±0.4 b	6.8 ±0.3 b	7.5 ±0.4 b	7.5 ±0.7 B
100	11.2 ±0.6 bc	10 ±0.5 c	9.1 ±0.4 a	10.4 ±0.5 c	10.2 ±0.9 C
250	14.8 ±0.7 cd	13.5 ±0.6 d	12.4 ±0.5 c	13.2 ±0.6 d	13.5 ±1 D
500	18.1 ±0.8 de	16.4 ±0.7 e	15.6 ±0.6 d	16.8 ±0.7 e	16.7 ±1 E
1 000	21.3 ±1 e	19.8 ±0.9 f	18.3 ±0.7 e	20.1 ±0.8 f	19.9 ±1.2 F
Control (tebuconazole)	1.5 ±0.5 f	1.4 ±0.6 f	1.6 ±0.3 f	1.5 ±0.1 f	1.5 ±0.1 G

Letras diferentes en la columna de cada patógeno indican diferencias significativas según la prueba de Tukey (p≤ 0.05). Los valores en paréntesis representan el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial comparado con el control. El factor aceite (C) muestra el promedio del diámetro del halo de inhibición para cada concentración, considerando todos los patógenos.

El diámetro del halo de inhibición para F. verticillioides aumentó con la concentración del aceite esencial, desde 8.5 mm a 50 ppm hasta 21.3 mm a 1 000 ppm, lo que sugiere una inhibición dosis-dependiente del crecimiento micelial de este patógeno, tal como lo confirman Achar y Sreenivasa (2021) que con aceites esenciales de orégano, tomillo y eucalipto han demostraron una alta eficacia en la inhibición de F. verticillioides, con reducciones en el crecimiento micelial de hasta 86% a concentraciones similares.

Para A. flavus, se observó un incremento en el diámetro del halo de inhibición de 7.2 mm a 50 ppm a 19.8 mm a 1 000 ppm, por lo que la efectividad del aceite esencial de S. molle contra este patógeno resalta su potencial en la prevención de la contaminación por aflatoxinas en cultivos de maíz, tal como lo sugieren Kohiyama et al. (2015) para el caso de aceite de tomillo en la inhibición de A. flavus de manera significativa.

En cuanto a U. maydis, el halo de inhibición aumentó de 6.8 mm (50 ppm) a 18.3 mm (1 000 ppm), siendo ligeramente menor en comparación con otros patógenos, demostrando ser efectivo en inhibir el crecimiento de este agente causal del carbón de la espiga del maíz, tal como lo reportan Falcão et al. (2010) con aceites de menta y citronela para reducir significativamente el crecimiento de U. maydis.

En el caso de C. graminicola, el diámetro del halo de inhibición aumentó de 7.5 mm con 50 ppm a 20.1 mm con 1 000 ppm, demostrando una alta efectividad del aceite esencial contra éste patógeno, lo cual sugiere su uso potencial en el manejo de la antracnosis del maíz, tal como lo reportan Perczak et al. (2019) mediante el uso de aceites de albahaca y clavo para inhibir el crecimiento de Colletotrichum spp., de manera efectiva.

En el control con Tebuconazole, se mostraron halos de inhibición menores, con aproximadamente 1.5 mm para todos los patógenos, lo que confirma la superioridad del aceite esencial como agente antifúngico natural. Los resultados obtenidos sugieren que el aceite esencial de S. molle puede ser una alternativa prometedora a los fungicidas sintéticos para el control de patógenos en cultivos de maíz, contribuyendo a prácticas agrícolas más sostenibles y menos dependientes de productos químicos.

Los resultados de los ensayos evidencian una reducción en la viabilidad celular de los patógenos evaluados con el aumento de la concentración del aceite esencial de S. molle, tal como se aprecia en el (Cuadro 3). A concentraciones de 1 000 ppm, la viabilidad relativa de todos los patógenos disminuyó a menos del 10%, destacando una actividad antifúngica del aceite esencial en comparación con el control positivo de Tebuconazole.

Cuadro 3

Patógeno	Concentración (ppm)	Absorbancia (570 nm)	Viabilidad relativa (%)
Fusarium verticillioides	0 (control)	1.2 ±0.05	100 ±0 a
	50	1.02 ±0.04	85 ±3 b
	100	0.84 ±0.03	70 ±4 c
	250	0.66 ±0.05	55 ±5 d
	500	0.48 ±0.03	40 ±3 e
	1 000	0.06 ±0.02	5 ±2 f
	Control (tebuconazole)	0.018 ±0.01	1.5 ±0.5 g
Aspergillus flavus	0 (control)	1.25 ±0.06	100 ±0 a
	50	1 ±0.05	80 ±4 b
	100	0.81 ±0.04	65 ±3 c
	250	0.625 ± .05	50 ±4 d
	500	0.438 ± .03	35 ±3 e
	1 000	0.063 ±0.02	5 ±2 f
	Control (Tebuconazole)	0.019 ±0.01	1.5 ±0.6 g
Ustilago maydis	0 (Control)	1.18 ±0.05	100 ±0 a
	50	1.04 ±0.04	88 ±2 b
	100	0.885 ±0.03	75 ±3 c
	250	0.71 ±0.05	60 ±5 d
	500	0.53 ±0.03	45 ±3 e
	1 000	0.12 ±0.02	10 ±2 f
	Control (Tebuconazole)	0.018 ±0.01	1.5 ±0.3 g
Colletotrichum graminicola	0 (Control)	1.22 ±0.05	100 ±0 a
	50	1.02 ±0.04	84 ±3 b
	100	0.83 ±0.04	68 ±4 c
	250	0.635 ±0.05	52 ±4 d
	500	0.465 ±0.03	38 ±3 e
	1 000	0.098 ±0.02	8 ±3 f
	Control (Tebuconazole)	0.018 ±0.01	1.5 ±0.1 g

Letras diferentes en la columna de cada patógeno indican diferencias significativas según la prueba de Tukey (p≤ 0.05).

El aceite esencial de S. molle redujo la viabilidad de F. verticillioides, de un 85% a 50 ppm a un 5% a 1 000 ppm, en A. flavus, desde un 80% a 50 ppm hasta un 5% a 1 000 ppm, en U. maydis, se redujo desde un 88% a 50 ppm hasta un 10% a 1 000 ppm y en C. graminicola, desde un 84% a 50 ppm hasta un 8% a 1 000 ppm, indicando actividad antifúngica dosis-dependiente, pudiendo atribuirse a compuestos como el α-pineno y el limoneno, conocidos por ser antimicrobianos (Prado et al., 2019; Tian et al., 2022).

El control positivo con Tebuconazole mostró una viabilidad relativa baja para todos los patógenos probados, con valores alrededor del 1.5%, esto indica que es efectivo como agente antimicrobiano; sin embargo, su uso en aplicaciones agrícolas está limitado debido a efectos negativos como la acumulación de residuos en el suelo, que puede reducir la biodiversidad microbiana, así como el desarrollo de resistencia en los patógenos tratados, lo que compromete su efectividad a largo plazo (Han et al., 2021)​.