elocation-id: e3747
La mutagénesis inducida por agentes físicos como la radiación gamma de Co60 en células o tejidos vegetales, genera cambios estructurales del ácido desoxirribonucleico e incrementó la variabilidad genética en los cultivos de importancia agrícola. Con frecuencia el material de inicio son especies vegetales establecidas en cultivos in vitro, lo que facilita el manejo y control de las condiciones fisicoquímicas además de incrementar el número de repeticiones en un mínimo espacio. Como producto se espera obtener variedades mejoradas con tolerancia a factores bióticos o abióticos además de mejorar las cualidades morfológicas y nutricionales. Esta revisión del estudio del arte recopiló información de los últimos 10 años para brindar un panorama actual del efecto de la radiación gamma sobre tejidos vegetales in vitro, abordando desde las fuentes de radiación, tipos de daño y mecanismos de reparación del ácido desoxirribonucleico, además del uso de marcadores moleculares para evidenciar las variaciones a nivel genético. Se analizarán los casos de éxito para cultivos de importancia agroindustrial en México compartiendo las expectativas actuales en el uso de esta tecnología.
cultivo de tejidos vegetales, fitomejoramiento, radiación ionizante.
La mutagénesis es una técnica común para mejorar genéticamente cultivos de valor económico, induciendo cambios en la secuencia de DNA (Spencer et al., 2021). La mutagénesis puede ser inducida mediante agentes mutágenos como la radiación gamma (Mba, 2013). La mutagénesis inducida por radiación gamma (MIRG) se ha utilizado en plantas medicinales, ornamentales y frutales para mejorar características como contenido nutricional, vida de anaquel, productividad, calidad y resistencia a enfermedades (Mba, 2013; Udage, 2021). Actualmente, más de 40% de las variedades obtenidas por mutagénesis se han desarrollado a través de MIRG (IAEA, 2022b). Tradicionalmente, el método MIRG fue aplicado en semillas; sin embargo, este proceso podía llevar hasta 9 años obtener resultados, pero en las últimas décadas, se asociado con el cultivo de tejidos vegetales, permitió obtener nuevas variedades en aproximadamente 2 a 3 años (Mba, 2013; Spencer et al., 2021). Este estudio proporciona una visión general de los efectos de la radiación gamma en el mejoramiento de las características nutricionales y fitoquímicas en cultivos in vitro de importancia alimenticia.
La radiación gamma es emitida por radioisótopos como cobalto-60 (Co60), cesio-137 (Cs137) y en menor medida por plutonio-239 (Pu239) (Mba, 2013; Udage, 2021). Esta radiación consiste en ondas electromagnéticas con longitudes menores a 1x10-11 m y niveles energéticos alrededor de 1.36 MeV (Spencer et al., 2021), capaces de ionizar átomos al desplazar los electrones de sus orbitales externos. La ionización de átomos puede provocar diversos efectos en las células (Oladosu et al., 2016).
La radiación ejerce su efecto mediante dos mecanismos: la acción directa (física), que se refleja en el daño de la molécula y la acción indirecta (química) de radicales libre (Figura 1A) (Spencer et al., 2021; Riviello-Flores et al., 2022). La acción indirecta implica la absorción de energía por la molécula de agua, provocando su disociación (radiólisis). Esta absorción condice a la generación de iones H+ y radicales libres H• y OH•, provocando reacciones en cadena que producen especies reactivas de oxígeno secundarias (ERO), como el peróxido de hidrógeno (H2O2), superóxido (O2•−) y ion hidronio (H2O-) (Figura 1B) (Szwent, 2015; Puerta-Ortiz y Morales-Aramburo, 2020).
El daño por radicales libres se concentra en las bases nitrogenadas y los azúcares presentes en DNA, lo que provocan la sustitución de bases, despurinación espontánea generando alteraciones estructurales (Puerta-Ortiz y Morales-Aramburo, 2020). El daño directo resultante por exposición a la radiación implica cambios estructurales en las bases nitrogenadas del DNA, incluyendo la eliminación de bases (sitios AP), ruptura de puentes de hidrogeno y fracturas de cadena simple y doble (Figura 1C) (Szwent, 2015; Puerta-Ortiz y Morales-Aramburo, 2020). Para contrarrestar estos efectos, las células han desarrollado mecanismos preventivos para proteger y reparar el DNA afectado.
Los mecanismos de reparación incluyen la reparación por escisión de bases (REB), que aborda las roturas de una sola cadena y los sitios AP, así como la reparación por escisión de nucleótidos (REN), los entrecruzamientos o uniones interhebras (Manova y Gruszka, 2015). Además, la reparación de errores de coincidencia (RAE) sirve como el principal mecanismo responsable de corregir los cambios inducidos por inserciones, eliminaciones y bucles de DNA (Tafurt y Marin 2014; Manova y Gruszka, 2015).
En el caso de la ruptura de doble hebra (RDH), puede ser reparada por dos mecanismos: recombinación homologa (RH) y por extremos no homólogos (RENH) (Kariuki et al., 2019). La RH implica la reparación de extremos rotos del DNA utilizando una secuencia homóloga como plantilla. Por otro lado, la unión de extremos de DNA no homólogo implica la unión directa de las cadenas de DNA rotas sin el requisito de una secuencia homóloga (Tafurt y Marin, 2014; Kariuki et al., 2019). En este sentido, se ha encontrado que la dosis de radiación gamma en plantas se relaciona con la expresión de genes reparadores del DNA, como pcna y fen1 (involucrados en la reparación por escisión de bases y por apareamiento erróneo), rad51 (asociado a la recombinación homologa) y orc1 (envuelto en la replicación del DNA) (Kariuki et al., 2019), lo que sugiere un proceso de reparación más eficaz en tejidos recién formados.
La respuesta al daño celular inducido por iones también implica un aumento de la actividad enzimática de catalasa (CAT), peroxidasa (POD), superóxido dismutasa (SOD), glutatión reductasa (GR) y ascorbato peroxidasa (APX) (Ali et al., 2015; Ludovici et al., 2020). Además, moléculas neutralizantes no enzimáticas, como ácido ascórbico, glutatión, prolina, poliaminas, betalaínas, carotenos y flavonoides desempeñan un papel protector contra este tipo de estrés (Demidchik, 2015; Ludovici et al., 2020), lo que ha sido ampliamente documentado en trigo (Hong et al., 2014) y arroz (Kariuki, et al., 2019). Por lo tanto, una mayor acumulación de enzimas neutralizantes y moléculas antioxidantes prevendrían los efectos perjudiciales del estrés oxidativo en los tejidos vegetales e inhibirían los cambios en el DNA provocados por los radicales libres.
La eficiencia de obtención de mutantes mediante radiación gamma depende de la determinación de una dosis óptima de radiación. Dado que la frecuencia de las mutaciones está influenciada por la dosis, la tasa de exposición y la tolerancia de los tejidos (Oladosu et al., 2016), la evaluación de la radiosensibilidad y dosimetría en los programas de mejoramiento con agentes mutágenos se vuelve crucial. La dosimetría de radiación determina la cantidad o dosis absorbida por el material biológico, expresada en unidades Gray (1Gy =1 J kg-1= 100 R) (Spencer et al., 2021). La relación que existe entre la dosis absorbida y los efectos deletéreos de los tejidos se evidencian en la reducción de la tasa de germinación, altura de las plántulas, tasa de supervivencia, acumulación de biomasa, entre otros (Mba, 2013).
La evaluación de la radiosensibilidad del material biológico implica determinar una métrica de letalidad al aumentar la dosis de radiación (Oladosu et al., 2016). Esto permite el cálculo de dosis letales que afectan porcentajes específicos (DL30, DL40, DL50 y DL60) de la muestra irradiada o que reducen el crecimiento del tejido (GL30, GL40, GL50 y GL60) facilitando la identificación de mutaciones en la población sobreviviente (Mba, 2013; Riviello-Flores et al., 2022). La DL50 y GL50 se emplean como referencia al irradiar poblaciones grandes (mayores a 400 individuos), incrementando la probabilidad de obtener materiales de interés (Penna y Bhagwat, 2023). Sin embargo, persisten cuestionamientos sobre la arbitrariedad de estos valores debido al riesgo de pasar por alto mutaciones deseables que pueden aparecer a dosis bajas de radiación (Mba, 2013).
Por lo que, es importante equilibrar entre las dosis efectivas para generar variaciones en las secuencias de DNA, sin acarrear mutaciones perjudícales o reducciones considerables en el tamaño de la población. Estudios recientes de radiosensibilidad han demostrado que los tejidos indiferenciados como callos y embriones somáticos son más sensibles a la radiación gamma (12-60 Gy) debido a su alto contenido de agua, en contraste a las semillas (38-184 Gy) o tejidos lignificados como brotes, plántulas, raíces y yemas 23-250 Gy) (Abdelnour-Esquivel et al., 2020; Pérez-Jiménez et al., 2020; Royani et al., 2021; Huerta-Olalde et al., 2022).
Por ejemplo, Royani et al. (2021) investigaron en cultivos de añil (Indigofera zollingeriana) y encontraron mayor sensibilidad en semillas con una DL50 de 184 Gy, mientras que los tejidos más lignificados (plántulas) exhibieron mayor tolerancia (254 Gy). En contrate, Pérez et al. (2020) estudiaron plantas de Citrus spp. y observaron que las semillas fueron más resistentes a la radiación gamma, con valores de DL50 de 127 Gy en Alemow y 156 Gy en naranja agria, comparado con las yemas de los cultivos de limón (DL50 de 25-26 Gy). De modo que, la pérdida de explantes y capacidad de regeneración de plántulas depende de la especie, fisiología, genética y etapa de desarrollo durante los procesos MIRG.
Las mutaciones naturales son reconocidas por su capacidad para inducir variabilidad genética con baja frecuencia (10-5 y 10-8) en plantas cultivadas (Spencer et al., 2021). Para superar esta limitante, la MIRG emerge como una herramienta valiosa al aumentar la frecuencia de las mutaciones y facilitar la selección de rasgos agronómicos deseables.
El Cuadro 1 ilustra los beneficios de MIRG en la mejora de cultivos. Una de las principales ventajas es la capacidad para inducir mutaciones que incrementen la tolerancia de los cultivos al estrés biótico como enfermedades y abiótico incluyendo estrés hídrico, salino y al frío. Al igual que, aumentar significativamente la productividad y mejorar el contenido nutricional de los cultivos sin comprometer su rendimiento. Esto ofrece el potencial para desarrollar variedades mejoradas con un mayor valor nutricional, abordando las deficiencias nutricionales y mejorando la calidad general de los productos agrícolas.
| Especie | Tejido | Fuente | Resultados | Autores(as) | |
|---|---|---|---|---|---|
| Dosis letal media (DL50) | Líneas sobre salientes | ||||
| * R. fruticosus ‘Tupy’ (zarzamora) | Brotes | Co60 | 30.8 Gy | Resistentes a B. cinerea | Huerta-Olalde et al. (2022) |
| * O. sativa L. (arroz) | Semillas Callo embriogénico | Co60 | SD (semilla) 60 Gy (callo) | Tolerancia estrés salino y sorbitol | Abdelnour-Esquivel et al. (2020) |
| *** A. tequilana cv Azul (agave) | Plántulas | Co60 | SD | Incremento en fructosa y sacarosa | Ángeles-Espino et al. (2020) |
| * *** Z. ofcinale Rosc. (jengibre) | Brotes | Co60 | 56 Gy | Incremento en gingerol resistentes a F. oxysporum f.sp. zingiberi | Sharma et al. (2020) |
| *** P. ginseng Mayer (ginseng) | Callo y raíces | Co60 | 20-75 Gy (Callo) 23.7-52.3 Gy (Raíz) | Incremento en ginsenósidos | Le et al. (2019) |
| *** V. mungo L. Hepper (frijol negro) | Semillas | Co60 | SD | Incremento de azucares reductores, almidón, aminoácidos y proteínas | Yasmin et al. (2019) |
El uso de radiación gamma ha demostrado ser efectiva en el desarrolló de plantas in vitro con características deseables, como tolerancia al estrés abiótico. En ese sentido, se han generado variedades prometedoras con resistencia al alto contenido de sales (Cuadro 1). Tal es el caso de lo reportado por Abdelnour-Esquivel et al. (2020), quienes obtuvieron líneas de arroz (O. sativa L.) con mayor resistencia al cloruro de sodio (NaCl) a una concentración de 200 mM.
Estas plantas mutantes mostraron una resistencia 75% mayor al NaCl y dos veces más al contenido de sorbitol (10% p/v) respecto al material de referencia. Del mismo modo, Nikam et al. (2015) reportaron resultados positivos en plantas de caña (Saccharum officinarum L.) regeneradas a partir de callos irradiados mantenidos en estrés salino (100 mM de NaCl). Ellos identificaron 18 materiales mutantes que exhibieron mayor producción total de caña (25%), caña comercial (12%), grados Brix (6%) y sacarosa (10%), en contraste a su control.
El efecto de MIRG in vitro en la generación de plantas resistente a metales pesados no ha sido estudiada de manera exhaustiva. Sin embargo, Qi et al. (2015) expusieron semillas de Arabidopsis thaliana a diferentes dosis de radiación (0 a 150 Gy), las cuales fueron germinadas in vitro en presencia de CdCl2 y Pb(NO3)2. Los resultados mostraron incrementos significativos en el índice de germinación (25 y 32%) y la longitud de raíces (20 y 42%), en plantas expuestas a Cd y Pb.
Además, de aumentos en la actividad enzimática de SOD (50% y 70%), POD (22% y 52%) y CAT (139% y 112%). La exposición de plantas a metales pesados desencadena un desequilibrio en la formación de ERO’s, lo que conduce a estrés oxidativo poniendo en riesgo la sobrevivencia del cultivo. Esto conlleva a un aumento de enzimas neutralizantes de radicales libres para mitigar los efectos perjudiciales y preservar la homeostasis celular.
Por otro lado, la MIRG ofrece un enfoque valioso para obtener plantas resistentes a enfermedades, siendo el cultivo in vitro una herramienta frecuente durante la selección, ya que permite incluir el propio patógeno, metabolitos, toxinas o filtrados de microorganismos en el medio de cultivo (Penna y Bhagwat, 2023), lo que facilita la identificación y selección de líneas élite (Cuadro 1). Sharma et al. (2020) llevaron a cabo un estudio sobre brotes de jengibre (Zingiber officinale Rosc.) expuestos a filtrados de cultivo fúngico (FCF) de Fusarium Oxysporum f. sp. zingiberi. en el cual se logró obtener materiales tolerantes en un 15 y 17.5% de FCF, evaluaciones in vivo confirmaron una mejora significativa en la resistencia de estos materiales (46.4 y 52% respectivamente).
Resultados similares fueron publicados por Huerta-Olalde et al. (2022), que evaluaron el efecto de los filtrados de micelio de Botrytis cinérea en brotes de zarzamora (Rubus fruticosus ‘Tupy’) in vitro irradiados con rayos gamma. Ellos identificaron diez líneas que superaron el 50% de supervivencia en términos de tejidos cloróticos y necrosados, solo dos materiales (rfgum5 y rfgum6) con signos de infección como desprendimiento de hojas o crecimiento de micelio, además que no se reportaron cambios fenotípicos durante su multiplicación y desarrollo.
Las variedades elite obtenidas mediante MIRG frecuentemente presentan alteraciones metabólicas, fitoquímicas y nutrimentales. Un ejemplo importante es el estudio realizado por Yasmin et al. (2019) en frijol negro (Vigna mungo L.) expuesto a 800 Gy de radiación gamma, mostraron aumentos en el contenido de azucares reductores, almidón, proteínas y aminoácidos en un 26, 32, 28 y 21%, respectivamente. Estos hallazgos sugieren que la MIRG tiene el potencial de ser una herramienta para mejorar el contenido nutricional.
MIRG no solo ha mejorado el contenido nutrimental de cultivos, sino también ha optimizado el contenido fitoquímico, realzando las propiedades bioactivas y proporcionando alimentos de alto valor. Le et al. (2019) generaron cuatro líneas mutantes (1G-20-12, 1G-20-16, 1G-20-19 y 1G-20-20) de raíces de ginseng (P. ginseng Mayer), con aumentos en el número (hasta cuatro veces), longitud (hasta nueve veces) y peso seco (hasta seis veces). Además del contenido de ginsenósidos como protopanaxatriol y protopanaxadiol que aumentaron de seis a diez veces. Resultados similares fueron reportados por Sharman y Tjarkur (2021), donde los brotes de jengibre (Z. officinale rosc.) irradiados mostraron cambios en la acumulación de aceites esenciales, oleorresinas y 6-gingerol en un 56% más en comparación con los no irradiados.
Del mismo modo Ángeles-Espino et al. (2020), generaron líneas mutantes de Agave tequilana después de dos ciclos de irradiación (0 y 25 Gy). Estas plantas mutantes duplicaron el contenido de glucosa fructosa y sacarosa, así como una mayor acumulación de neokestosa, kestotetrosa y kestopentosa, que son fructooligosacáridos de alto valor en la familia de las Agaváceas.
El análisis molecular del DNA abarca una variedad de técnicas esenciales para los programas de MIRG, ya que validan la presencia de materiales mutantes y epimutantes entre grupos de materiales irradiados (Riviello-Flores et al., 2022; Bhat et al., 2023). Los marcadores moleculares basados reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como SSR e ISSR, son frecuentemente utilizados (Due et al., 2019; Bhat et al., 2023) en los programas de mejoramiento por mutagénesis.
Por ejemplo, los marcadores ISSR han mostrados resultados eficientes para identificar DNA polimórfico en mutantes derivadas de banana (M. paradisiaca cv. sapientum), trabajo en el cual los autores lograron obtener nueve bandas, ocho de ellas polimórficas. Lo que mostró, un alto nivel de variación genética (90%) y coeficiente de similaridad (47%) entre los materiales con cambios morfológicas destacados y el material de referencia (Due et al., 2019).
En la actualidad han sido desarrollado métodos con marcadores avanzados (SRAP, SCoT, DArT, QTL) y aplicados con éxito en trabajos de investigación, tal es el caso de El-Fiki et al. (2021) al usar diez marcadores SCoT e ISSR en tomate (L. esculentum Mill.) identificaron 114 y 101 bandas respectivamente, donde el porcentaje promedio de bandas polimórficas de los marcadores ISSR fue menor que en contraste a SCoT (40 y 65% respectivamente). Lo que reflejo el promedio del índice marcador más alto para SCoT (0.34) en comparación con los marcadores ISSR (0.15). A pesar de que los valores del contenido de información polimórfica (PIC) en ambas técnicas fueron altamente informativos (0.429 y 0.347), los marcadores SCoT brindaron más información sobre la variación polimórfica detectada.
Si bien cualquier grupo de marcadores moleculares provee información sobre variaciones génicas, su selección es fundamental para alcanzar los objetivos planteados, considerando factores como la secuenciación previa, reproducibilidad, polimorfismo, mecanismo de acción génica, calidad y cantidad de DNA requerida, índice marcador y costo (Nadeem et al., 2018; Bhat et al., 2023). Por lo que, el uso de nuevos marcadores como SCoT, SNP, QTL, SRAP, DArT y RBIP han mostrado mayor control sobre algunos de estos factores (Nadeem et al., 2018; El-Fiki et al., 2021; Bali, 2023; Bhat et al., 2023).
En conclusión, la mutagénesis inducida por radiación gamma (MIRG) se ha destacado como una herramienta valiosa para el mejoramiento genético de cultivos in vitro de plantas con valor alimentario. Si bien ha generado variedades resistentes a enfermedades, tolerantes a sales e incrementos en los metabolitos de interés, hay limitada información sobre la tolerancia al estrés hídrico, temperatura, pH, metales pesados y mejoras nutricionales.
Sumado a que la mayoría de los programas se han centrado en cultivos de rápido crecimiento, dejando al descubierto los cultivos con ciclos más largos (uva, aguacate, guayaba y nopal). Tomando en cuenta los hallazgos de esta revisión, existe una oportunidad prometedora para utilizar MIRG en cultivos establecidos in vitro con lento crecimiento, ampliando así los beneficios para la agricultura sostenible y la producción de alimentarios con alto valor.
Abdelnour-Esquivel, A.; Pérez, J.; Rojas, M.; Vargas, W. y Gatica-Arias, A. 2020. Use of gamma radiation to induce mutations in rice (Oryza sativa L.) and the selection of lines with tolerance to salinity and drought. In vitro cellular and developmental biology plant. 56:88-97. https://doi.org/10.1007/s11627-019-10015-5.
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