elocation-id: e3733
El trabajo de investigación se desarrolló en el Laboratorio de Recursos Fitogenéticos de la Facultad de Agrobiología ‘Presidente Juárez’ de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, en 2019 y 2022. La investigación se planteó con el objetivo de evaluar la utilidad de los marcadores funcionales derivados del CYP450 para estudios de diversidad genética en Capsicum pubescens. El material genético consistió en 31 variedades cultivadas de C. pubescens procedentes de tres diferentes localidades del estado de Michoacán, México. El ADN genómico fue obtenido con base en el protocolo de Huang et al. (2013) y en el análisis se incluyeron dos combinaciones de cebadores del CYP450. Los productos de amplificación fueron separados en geles de acrilamida al 8% y teñidos con nitrato de plata. Un total de 85 loci fueron detectados: la combinación CYP2B6F/CYP2C19R, detectó 34 loci polimórficos; mientras que con la combinación CYP2C19F/CYP1A1R, solo 27. El análisis de diversidad de C. pubescens permitió identificar 1.54 alelos por locus, 1.33 número efectivo de alelos por locus, índice de Shannon de 0.3, un índice de heterocigosidad de 0.2 y un 60.39% de loci polimórficos. Los resultados obtenidos muestran que los marcadores derivados del CYP450, son una alternativa eficiente y de bajo costo para estudios de diversidad genética en especies vegetales.
Capsicum pubescens, variabilidad genética.
La especie C. pubescens conocida comúnmente como chile perón, manzano, canario, cera o rocoto (Escalera-Ordaz, 2019), es originaria de las partes altas de América del Sur, florece en zonas elevadas entre 1 200 y 3 000 msnm. En México, se encuentra en los estados de México, Puebla, Veracruz, Michoacán y Chiapas (Aguirre y Muñoz, 2015).
Esta especie presenta una diversidad de usos: medicinales, se consume en fresco, deshidratado o como alimentos en conserva es una fuente de colorantes naturales (Escalera-Ordaz, 2019).
Para un mayor concomiento, se han hecho estudios sobre la diversidad genética, estructura de poblaciones y relaciones filogenéticas. En este sentido, los marcadores moleculares son considerados una herramienta biotecnológica de importancia para la evaluación de la diversidad genética gracias a las características que poseen (Gil-Langarica, 2008). Entre las técnicas que se han utilizado se encuentran los AFLPs (Vos et al., 1995) y las secuencias de microsatélites como los ISSRs (Zietkiewiez et al., 1994) y SRAPs (Li y Quiros, 2001).
Sin embargo, en la actualidad estas técnicas presentan ciertas desventajas que pueden llegar a ser un obstáculo: requerimiento de grandes cantidades de ADN (Rentería, 2007), reproducibilidad (Ríos et al., 2009) y conocimiento previo de las secuencias de ADN, entre otras (Carvalho et al., 2015). Los trabajos de investigación en esta especie se han limitado principalmenteal en variedades, híbridos y líneas de diferentes especies de capsicum (Castañón-Nájera et al., 2011; Contreras-Toledo et al., 2011; Mahmoud, 2013; Carvalho et al., 2015; Toledo-Aguilar et al., 2016; Xiao-min et al., 2016; López-Espinosa et al., 2018). En contraste, con un menor nivel de investigación se encuentra C. pubescens (Pardey y García, 2011; Lijun y Xuexiao, 2012).
El citocromo CYP450 fue identificado en 1958 como un pigmento celular (Jaimes-Santoyo et al., 2014), se encuentra en bajas concentraciones en distintos órganos de las plantas y en algunos organelos celulares como son: retículo endoplásmico, membrana plasmática, vacuola, mitocondria y aparato de Golgi. Al respecto, se han identificado diferentes moléculas de citocromo CYP450 en un solo organismo (Valencia-Quintana et al., 2009) con diferentes funciones dentro de las plantas: síntesis de diversos compuestos de defensa contra insectos y patógenos, en la biosíntesis de las giberelinas, así como, en el proceso de maduración de frutos.
En Arabidopsis, se han determinado 270 genes pertenecientes a 45 distintas familias del CYP450 (Gonzáles-Mendoza, 2009), lo que hace del CYP450 una de las familias más grandes de proteínas enzimáticas en las plantas (Bak, 2011). Asimismo, se han aislado genes de la familia CYP88A en Cucurbita maxima (Helliwell et al., 2000) y Zea mays (Winkler y Helentjaris, 1995), de la familia CYP73A9v1 en Pisum sativum (Whitbred y Schuler, 2000) y CYP71A1 en Persea americana.
Los marcadores genómicos funcionales basados en el CYP450 (Shakeel et al., 2019), fueron originados a partir de un estudio en donde se evaluó el polimorfismo detectado por el CYP450 en mamíferos y posteriormente, utilizados como herramientas universales para evaluar la diversidad genética de especies vegetales. Alrededor de 51 especies han sido evaluadas con este marcador (Yamanaka et al., 2003) y con éxito en diferentes especies vegetales: Musa spp, (Wan et al., 2005), Withania coagulans (Gilani et al., 2009), Curcuma amada (Shakeel et al., 2019), Eleusine coracana (Panwar et al., 2010), Moringa oleífera (Saini et al., 2013), Oryza Sativa (Yamanaka et al., 2011), Sechium edule (Machida-Hirano et al., 2015), entre otras.
Los niveles de polimorfismo determinados oscilan desde 0.28% hasta un 88.25%. Dadas las características y los resultados obtenidos con el marcador CYP450 en estudios de diversidad genética en diferentes especies, se planteó su utilización para estudios preliminares de variabilidad genética en variedades cultivadas de C. pubescens.
En la presente investigación se utilizaron 31 variedades cultivadas de C. pubescens: 11 de ellas procedentes del municipio de Tingambato (TIN) y 20 de dos localidades del municipio de Uruapan: 11 de Toreo el Bajo (TOB) y 9 en Tiamba (TIA). Los sitios de origen de los materiales analizados oscilan entre los 1623 y 2282 msnm.
El ADN fue obtenido con base en el procedimiento descrito por Huang et al. (2013). Algunas modificaciones hechas consistieron en la liofilización del tejido foliar sin el uso previo de nitrógeno líquido y la sustitución de cloroformo y alcohol isoamílico por diclorometano (CH2Cl2) y etanol, respectivamente. La concentración del ADN aislado se determinó con la ayuda de un NanoDrop 2000c (Thermo Scientific®).
Para la obtención de amplicones se utilizaron 10 μl de la siguiente mezcla de reacción de PCR: 2.5 μl de ddH2O, 0.3 mM de MgCl, 0.6 μM de cada iniciador 3.5 μl 2X red Taq (0.7 X) y 2 μl de una solución de ADN (25 ng μl-1). Los oligonucleótidos utilizados fueron dos combinaciones de cebadores derivados del citocromo CYP450: CYP2B6F (5’ gac tct tgc tac tcc tgg gtt 3’)/CYP2C19R (3’ cca tcg att ctt ggt gtt ct 5’) y CYP2C19F (5’ tcc ttg tgc tct gtc tct ca 3’)/CYP1A1R (3’ aag gac atg ctc tga cca tt 5’) (Inui et al., 2000). Para la amplificación, se utilizó un termociclador 3 PrimeG techne®.
Para la combinación de oligos CYP2B6F/CYP2C19R fue el siguiente: una etapa inicial de 5 min a 94 °C, seguidos de 35 ciclos de amplificación de la siguiente manera: desnaturalización 60 s a 94 °C, hibridación 60 s a 47 °C y una extensión de 60 s a 72 °C. Para la combinación de oligos CYP2C19F/CYP1A1R la hibridación se realizó en 60 s a 54 °C. Para ambas combinaciones se incluyó una extensión final de 10 min a 72 °C. Los amplicones fueron separados mediante electroforesis en gel de acrilamida al 8% en sistemas verticales de 200 ml (EnduroTM Power Supplies 300V).
Los marcadores moleculares de referencia fueron de 20 pb y 100 pb. La detección de los productos amplificados se llevó a cabo mediante tinción por nitrato de plata y visualizados en un fotodocumentador Gel Logic 112 Carestream® (Sanguinetti y Simpson, 1994).
Para este procedimiento, se organizaron tres grupos de variedades, considerando como criterio de agrupamiento el sitio de procedencia. Los datos fueron analizados con el paquete estadístico GenAlex (Peakall y Smouse, 2012) para calcular parámetros de diversidad genética: número de alelos (N), número promedio de alelos/locus (Na), número efectivo de alelos (Ne), índice de Shannon (I), heterocigosidad (He) y porcentaje de loci polimórficos (% P). A partir de una matriz de promedios, se calculó la matriz de distancias genéticas entre variedades y se hizo el análisis de agrupamiento con el método de Neighbor-Joinning. El dendograma fue generado mediante el programa MEGA5 (Tamura et al., 2011).
Nivel de polimorfismo determinado. Las combinaciones utilizadas de marcadores generaron bandas entre 40 y 500 pb. Lo anterior, contrasta con lo obtenido por otros autores (Mahmoud, 2013) en estudios hechos en C. anuum, en este último caso, utilizaron marcadores codominantes del tipo ISSRs. En total fueron detectados 85 loci, la combinación CYP2B6F/CYP2C19R, reveló 34 bandas polimórficas; mientras que la combinación CYP2C19F/CYP1A1R, reveló 27 bandas polimórficas, para un nivel de polimorfismo de 60.39%, este valor fue superior en promedio en un 8.83%, al determinado en otras especies de Capsicum y un 29.14% superior al reportado (Pardey y García, 2011) para C. pubescens mediante SSRs.
En general las combinaciones del CYP450 detectaron un mayor nivel de polimorfismo, superior en un 41.9% y 35.59% con respecto al detectado con ISSRs (Lijun y Xuexiao, 2012) y con RAPDs (Bobadilla-Larios et al., 2017), respectivamente. En contraste, en estudios hechos en variedades de C. frutescens y C. annuum (Castañón-Nájera et al., 2011) y en poblaciones criollas de C. chinense (López-Espinosa et al., 2018) se han reportado niveles de polimorfismo promedio de 95.4% utilizando marcadores ISSRs y AFLPs.
Es de resaltar el nivel de polimorfismo (60.39%) determinado en C. pubescens en comparación al promedio (20.91%) detectado con otros marcadores (Pardey y García, 2011; Lijun y Xuexiao, 2012) en esta misma especie. Por otra parte, existen pocos estudios sobre la utilización de los marcadores derivados del CYP450 en otras especies vegetales, destacan los hechos en Musa ssp., y en Curcuma amada (Shakeel et al., 2019), en donde se han determinado polimorfismos de 65.2% y 94.6%, respectivamente.
Este tipo de marcadores se basa en una familia multigénica que registra la diversidad en regiones funcionales del genoma, esto explica los niveles de polimorfismo obtenidos y, por ende, se han empleado para caracterizar la diversidad genética y variabilidad de especies de insectos (Giraldo et al., 2011), mamíferos ungulados y cetáceos (Irwin et al., 1991).
Asimismo, los genes derivados del CYP450, ampliamente distribuidos dentro del genoma de las plantas, pueden emplearse universalmente; sin embargo, su utilización en especies vegetales (Yamanaka et al., 2003; Wan et al., 2005; Gilani et al., 2009; Panwar et al., 2010; Yamanaka et al., 2011; Saini et al., 2013; Machida-Hirano et al., 2015; Shakeel et al., 2019) ha sido limitada.
Análisis de diversidad genética. El análisis permitió identificar un promedio de 1.54 alelos por locus, 1.33 número efectivo de alelos por locus, un índice de Shannon de 0.3, un índice de heterocigosidad de 0.2 y un porcentaje de loci polimórficos de 60.39% (Cuadro 1). El valor de heterocigosidad estimado fue bajo (0.2), con respecto a los reportados por Xiao-min et al. (2016); Toledo-Aguilar et al. (2016) en donde se determinaron valores que oscilan de 0.36 a 0.59. La heterocigosidad determinada en C. annum (Contreras-Toledo et al., 2011), C. frutescens y C. chinense (Carvalho et al., 2015; López-Espinosa et al., 2018) con marcadores SSRs arrojó valores promedio de 0.42, superiores a los reportados en esta investigación.
| Poblaciones | Na | Nab | Nec | Id | Hee | Pf (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Toreo el Bajo | 11 | 1.66 | 1.38 | 0.34 | 0.23 | 67.06 |
| Tingambato | 11 | 1.55 | 1.31 | 0.29 | 0.19 | 60 |
| Uruapan | 9 | 1.42 | 1.3 | 0.27 | 0.18 | 54.12 |
| Media | 10.33 | 1.54 | 1.33 | 0.3 | 0.2 | 60.39 |
Resultados similares se han obtenido con el empleo de AFLPs (Guzmán et al., 2005) e ISSRs (Lijun y Xuexiao, 2012). También, se ha observado que cuando las especies indicadas se relacionan con C. Pubescens, se obtienen valores bajos de diversidad genética (Pardey y García, 2011).
Los marcadores funcionales CYP450 han mostrado su viabilidad para estimar altos niveles de diversidad genética, incluso en algunas especies vegetales como Musa spp., (Wan et al., 2005) y Oryza Sativa (Yamanaka et al., 2011). En este sentido, los valores de He determinados en las poblaciones estudiadas en las tres localidades fueron similares con un promedio de He= 0.2. Esto concuerda con los niveles de polimorfismo, estimados en cada una de las poblaciones indicadas.
La estimación del índice de diversidad de Shannon evidenció que la riqueza de individuos en la población de Uruapan fue de menor (I= 0.27), con respecto a las poblaciones de Tingambato y Toreo el Bajo (I= 0.29 e I= 0.34, respectivamente). El valor promedio estimado para este parámetro fue de I= 0.3 y puede estar en función de la homogeneidad de la población y de la frecuencia de alelos (Glasenapp et al., 2015). Los análisis de parámetros de diversidad genética obtenidos mediante CYP450 son similares (Machida-Hirano et al., 2015) a los generados con otro tipo de marcadores como los SSRs y RAPDs.
Relaciones de parentesco. En la Figura 1, se observó que los marcadores derivados del CYP450 identificaron dos grupos perfectamente definidos, ambos grupos no presentaron relación con las características morfológicas de los frutos, pero tampoco con su lugar de procedencia. En el dendograma se observó una politomía, ya que no se tiene suficiente información para explicar esta relación (Martínez, 2007). La formación de grupos con base en el polimorfismo detectado con marcadores derivados del CYP450 no se ha podido explicar (Wan et al., 2005; Gilani et al., 2009; Saini et al., 2013), es probable que al aumentar el número de iniciadores se pueda obtener más información sobre este tipo de agrupamientos (Wan et al., 2005).
En ambos grupos, destacan por su mayor similitud genética y con base en las secuencias analizadas, las variedades procedentes de la localidad de Tiamba: en el grupo 1 la TIA4 con TIA5 y en el grupo 2 la variedad TIA1 con TIA2. No obstante, en el grupo1 predominan las variedades cultivadas procedentes de la Tingambato, mientras que en grupo 2 las procedentes de la localidad de Toreo. La formación de grupos con base en el polimorfismo detectado con marcadores derivados del CYP450 no se ha podido explicar (Wan et al., 2005; Gilani et al., 2009; Saini et al., 2013), es muy probable que al aumentar el número de iniciadores se pueda obtener más información sobre este tipo de agrupamientos.
El uso de estos marcadores en mamíferos (Giraldo et al., 2011); así como, en la identificación de secuencias análogas de genes CYP450 en diferentes especies vegetales (Gonzáles-Mendoza, 2009; Bak, 2011) permitió que los CYP450 fueran considerados como una herramienta universal para la evaluación de la diversidad genética del genoma en diversas especies vegetales que no tienen marcadores genéticos relevantes.
Este tipo de marcadores representan un sistema ideal (Yamanaka et al., 2011) para revelar la diversidad genética presente en individuos, poblaciones y especies, ya que permiten detectar un alto nivel de polimorfismo, son rentables, con presupuestos limitados, sin diferencias significativas en cuanto a formación de grupos, pero útiles en la estimación de diversidad genética y de ensayo rápido (Panwar et al., 2010), los convierte en una alternativa confiable para estudios de diversidad genética (Shakeel et al., 2019) en especies vegetales.
Los resultados generados en este trabajo de investigación, en variedades cultivadas de C. Pubescens, muestran la utilidad de los marcadores funcionales derivados del CPY450 en estudios para generar información de manera rápida y no costosa sobre la variabilidad y diversidad genética de individuos o poblaciones de especies vegetales estrechamente relacionadas.
A la Coordinación de la Investigación Científica de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo (CIC-UMSNH) por el financiamiento parcial del proyecto y al Consejo Nacional de Humanidades Ciencias y Tecnologías (CONAHCYT) por la beca para estancia posdoctoral.
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