elocation-id: e3658
Este estudio investiga el efecto de la inoculación con Bradyrhizobium sp. (Lotus), una rizobacteria simbiótica, en la germinación del trébol bajo estrés inducido por cobre, cadmio y su combinación. El objetivo es destacar el papel de Bradyrhizobium sp. (Lotus) en la mitigación del estrés por cobre y cadmio y mejorar la germinación del trébol, una especie espontánea de interés forrajero. La investigación, realizada en Blida (Argelia) en 2024, se centra en los aspectos fisiológicos de la germinación, incluido el conteo total de germinación, el tiempo medio de germinación y la inhibición de la reversibilidad de la germinación. El análisis estadístico se realizó mediante Manova con un umbral del 5%. Los resultados indican que la inoculación con Bradyrhizobium sp. (Lotus) aumenta los valores de conteo total de germinación y reduce la fase de retardo de la germinación de +168 h a 48 h. Además, la inhibición de la germinación se reduce en un 20 a 30% en comparación con las semillas no inoculadas y los parámetros fisiológicos de germinación mejoran bajo condiciones de estrés por metal. Los hallazgos sugieren que Bradyrhizobium sp. (Lotus) puede mitigar el estrés por cobre y cadmio mediante la detoxificación o quelación, mejorando así la tolerancia del trébol a estos elementos traza metálicos durante la etapa de germinación.
cadmio, cobre, fisiología, PGPR.
El trébol tiene una gran importancia ecológica y agrícola debido a su adaptabilidad a diversos ambientes y su papel como leguminosa forrajera. Contribuye a la fertilidad del suelo a través de la fijación biológica de nitrógeno, lo que mejora el contenido de nutrientes del suelo y reduce la necesidad de fertilizantes químicos, lo que lo convierte en un candidato ideal para la agricultura sostenible (Smýkal et al., 2015). Su capacidad para prosperar en suelos pobres en nutrientes lo hace particularmente valioso en los esfuerzos de restauración de tierras (Brockwell et al., 2005).
Las iniciativas de desarrollo sostenible a nivel mundial enfatizan cada vez más la incompatibilidad de la contaminación ambiental, en particular de los compuestos persistentes como los oligoelementos metálicos, con la integridad ecológica. Estos elementos, estables y persistentes, plantean importantes riesgos de contaminación al acumularse en los ecosistemas y transferirse a organismos superiores, afectando así a la salud pública y al equilibrio ecológico (Croteau et al., 2005; DeForest et al., 2007). Algunos metales exhiben toxicidad incluso a bajas concentraciones (Mills et al., 1977).
Los microorganismos, particularmente las bacterias, desempeñan un papel vital como constructores, reguladores, fijadores y estabilizadores en el medio ambiente, como la fijación de nitrógeno atmosférico por parte de las rizobacterias (Brockwell et al., 2005). Su diversidad y actividad pueden verse significativamente afectadas por varios factores, incluyendo altas concentraciones de iones metálicos en el suelo, que inducen cambios estructurales, bioquímicos y fisiológicos en las semillas, reduciendo en última instancia las tasas de germinación y retrasando el desarrollo de las plantas (Ashraf et al., 2007).
A pesar de las numerosas limitaciones ambientales que pueden impedir la germinación de las semillas, pocos estudios han explorado el impacto del estrés por oligoelementos metálicos en la germinación. El objetivo de este estudio es evaluar el papel de la inoculación de la rizobacteria Bradyrhizobium sp. (Lotus) en la mitigación del deterioro de la germinación de semillas de trébol bajo estrés por cobre.
Las semillas utilizadas en este experimento son de Lotus ornithopodioides L., una fabácea espontánea con carácter forrajero. Lotus ornithopodioides L. es silvestre con distribución en el Mediterráneo. Las semillas se recolectaron en la región de Soumâa (Blida-Argelia) en mayo de 2023.
La bacteria utilizada en este experimento es Bradyrhizobium sp. (Lotus) aislada de nódulos de Lotus ornithopodioides L. Se utiliza en una concentración de 108 UFC ml-1 a las 24 h (Degaichia et al., 2024).
La esterilización de las semillas se lleva a cabo según el método de Vincent (1970) y Somasegaran et al. (1994). La inoculación de las semillas por Bradyrhizobium sp. (Lotus) se llevó a cabo según el método recomendado por Silini et al. (2016).
Las semillas se germinaron en placas de Petri (20 semillas por placa) cuyo fondo se cubrió con una doble capa de papel de filtro empapado en agua destilada (testigo), soluciones de diferentes concentraciones de CdCl2 y CuCl22H2O (Sigma-Alrdich; pureza 99.99%) (pruebas). La germinación se llevó a cabo en la oscuridad a una temperatura de 25 °C (Mihoub et al., 2005) (Cuadro 1).
La tasa de germinación acumulada (TGA) se determinó de acuerdo con la siguiente fórmula (Bouton et al., 1976).
Donde: G2, G4 y G6 son los porcentajes de germinación a los 2, 4 y 6 días después del inicio de la germinación.
Es la relación entre el porcentaje de germinación final (TG%) y el número de días hasta la germinación final (N) designada por GMD (Osborne et al., 1993).
La velocidad de germinación (TMG) se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula (Come, 1970).
Donde: N1 es el número de semillas germinadas en el momento T1; N2 es el número de semillas germinadas en el intervalo T1 -T2.
El porcentaje de inhibición (I%) de la germinación se calculó según El Hadji-Djibo et al. (2014) de la siguiente manera:
Donde: Xi= número de semillas que han germinado en el medio de control; Yi= número de semillas que han germinado en el medio que contiene Cu(II) o Cd(II).
Se utilizaron las 20 semillas germinadas en presencia de C1, C2 y C3 de metales traza (MT) durante siete días. Entre estas semillas se eligieron las que no germinaron. Se enjuagaron tres veces y luego se transfirieron a un medio que contenía agua destilada durante veinte días adicionales. El porcentaje de recuperación de la germinación (RG%) se determinó mediante la siguiente fórmula (Bennani et al., 2015):
Donde: a= número total de semillas germinadas después de ser transferidas al agua destilada; b= número total de semillas germinadas en una solución que contiene MT; C= número total de semillas germinadas.
Diez semillas no inoculadas se colocaron en un medio suplementado con 10 ml de solución que contenía diferentes concentraciones de cadmio y cobre o soluciones iso-osmóticas de manitol (Bennani et al., 2015) (Cuadro 2).
| Cu(II) | Cd(II) | Cu(II)+Cd(II) | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MT (µg ml-1 ) | 1 500 | 2 000 | 3 000 | 2 000 | 3 500 | 6 000 | I | II | III |
| Manitol (g L-1 ) | 5.08 | 10.16 | 15.24 | 0.5 | 1.01 | 1.52 | 6 | 11.18 | 16.77 |
La incubación duró 20 días (Bennani et al., 2015). La ley de Van’t Hoff se utiliza para calcular las soluciones iso-osmóticas del manitol:
Donde: π= presión osmótica (Pa); R= constante de gas ideal 8.314 (UI); T= temperatura absoluta en °K 273 + temperatura en °C; n= número de moles de soluto; V= volumen (m3); i= número de partículas formadas por disociación del soluto; φ(phi)= coeficiente osmótico= factor de corrección.
El tipo de interacción entre los dos MT se evaluó mediante la fórmula de Abbott (Gisi, 1996). En este modelo, la inhibición de la germinación teórica de la mezcla, Ith, expresada en porcentaje, se determinó de acuerdo con la siguiente fórmula:
Donde: IA e IB representan las inhibiciones causadas por los MT solos (cobre y cadmio, respectivamente). La tasa de inhibición (TI) correspondiente a cada combinación se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:
Los valores de (TI) mayores que 1 indican una sinergia entre los dos MT; los valores de (TI) menores que 1 significan antagonismo entre los dos MT; los valores de (TI) iguales a 1 corresponden a una aditividad de los efectos.
El análisis estadístico de los resultados se realizó con el programa SPSS© versión 20.0.0 para Windows™. Los experimentos se replicaron seis veces, mostrando consistentemente tendencias similares según la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk (p= 0.89 > 0.05). Las pruebas de Manova se realizaron con un nivel de significancia del 5% para evaluar el impacto de la inoculación bacteriana en los parámetros. Además, se evaluó el efecto de Bradyrhizobium sp. (Lotus) sobre la toxicidad iónica durante la germinación en condiciones metálicas mediante la prueba binomial.
Los resultados ilustran los efectos de diferentes concentraciones de cobre y cadmio sobre los parámetros de germinación de las semillas, con y sin inoculación de Bradyrhizobium sp. (Lotus) (Cuadro 3).
[i] Conc= concentración de MT (μg ml-1); Nino= semillas no inoculadas; Ino= semillas inoculadas. Las medias seguidas de la misma letra mayúscula en filas y minúscula en columnas, no difieren estadísticamente entre sí según la prueba t de Student y la prueba de Tukey, respectivamente, con un 5% de probabilidad.
Sin embargo, la inoculación con Bradyrhizobium sp. (Lotus) condujo a una mejora en los valores de TGA. En un ambiente cádmico, la presencia de Bradyrhizobium sp. (Lotus) resultó en una TGA superior al 45% a una concentración de cadmio de 2 000 μg ml-1, la cual disminuyó a 18.33% a 6 000 μg ml-1. La germinación del trébol en un medio mixto de cobre y cadmio mostró una disminución proporcional de TGA con concentraciones crecientes. Los valores más altos de TGA se registraron a 1 500 y 2 000 μg ml-1 de Cu:Cd (20%). En general, el análisis multivariado de varianza (Manova) confirmó que Bradyrhizobium sp. (Lotus) impactó significativamente la tasa de germinación acumulada (p= 0 < 0.05).
Después de siete días de tratamiento con metales, el proceso de germinación se puede dividir en tres fases distintas:
1) fase de latencia: en condiciones de control y con un medio cúprico de 1 500 μg ml-1 inoculado con Bradyrhizobium sp. (Lotus), esta fase dura aproximadamente 24 h. No obstante, en semillas estresadas por metales con inoculación de Bradyrhizobium sp. (Lotus), esta fase se extiende a 48 h. En contraste, sin la inoculación de Bradyrhizobium sp. (Lotus), particularmente en semillas tratadas con mezclas metálicas (1 500:2 000 μg ml-1 y 2 000:3 500 μg ml-1 Cu:Cd), la fase de latencia dura significativamente más tiempo, hasta 96 y 144 h, respectivamente.
2) fase lineal: las semillas inoculadas muestran un aumento inicial más pronunciado en la tasa de germinación en comparación con las semillas no inoculadas. Sin embargo, esta fase lineal está ausente en las semillas sometidas a diferentes tratamientos metálicos sin inoculación de Bradyrhizobium sp. (Lotus).
3) Fase final de germinación: representa el porcentaje final de germinación, reflejando la capacidad global de germinación en condiciones experimentales. En condiciones de control, la tasa de germinación alcanza su máximo (100%) después de 3 a 4 días, independientemente de la inoculación de Bradyrhizobium sp. (Lotus). Bajo estrés metálico y con inoculación de Bradyrhizobium sp. (Lotus), la tasa de germinación final se logra mucho más rápidamente en comparación con las semillas no inoculadas en condiciones similares (Figura 1).
Bajo estrés metálico sin inoculación bacteriana, la GMD cae a 0%, lo que es consistente entre las diferentes concentraciones de cobre, cadmio y tratamientos combinados de cobre-cadmio (3 000:6 000 μg ml-1).
La GMD sigue siendo notablemente baja a concentraciones de 1 500:2 000 μg ml-1 y 2 000:3 500 μg ml-1 en el medio combinado de cobre y cadmio, al 1.43% y al 0.71%, respectivamente. Las semillas inoculadas muestran una GMD más alta en comparación con las semillas no inoculadas. Con el aumento de las concentraciones de cadmio, los valores de la GMD disminuyen; por ejemplo, a 2 000 μg ml-1, la GMD alcanza 8.75%, que es moderado en comparación con el control (33.33%).
La GMD disminuye proporcionalmente con el aumento de la concentración. La GMD más baja se observa a una concentración de cobre de 1 500 μg ml-1 (2.86%), la cual aumenta a 4.29% a 2 000 y 3 000 μg ml-1. Bajo estrés metálico en un medio cúprico-cádmico con inoculación de Bradyrhizobium sp. (Lotus), la GMD promedio de semillas de trébol disminuye con el aumento de las concentraciones de metales.
El valor máximo registrado es de 5.71% para la concentración de 1 500:2 000 μg ml-1 (Cu:Cd). El análisis multivariado de varianza (Manova) indica un impacto significativo de Bradyrhizobium sp. (Lotus) en la tasa promedio diaria de germinación (p= 0 <0.05).
Las semillas germinadas en agua destilada tuvieron un tiempo medio de germinación (TMG) de 1.9 días. No obstante, no se pudo calcular el TMG para las semillas germinadas en soluciones puras de cadmio o cobre debido a la ausencia de germinación en todas las concentraciones analizadas. Bajo estrés metálico sin inoculación bacteriana, la velocidad de germinación (TMG) disminuyó entre un 50% y un 90% en comparación con el control cuando se utilizó una mezcla de cobre y cadmio, con reducciones proporcionales a la concentración, excepto a 3 000:6 000 μg ml-1 (Cu:Cd) donde no se produjo germinación.
El TMG del control (1.6 días) disminuyó en presencia de Bradyrhizobium sp. (Lotus), lo que indica un aumento de la velocidad de germinación con la inoculación bacteriana. Después de la inoculación, hubo una reducción en la velocidad de germinación proporcional a la concentración de cadmio, alcanzando un TMG= 4.75 días para 6 000 μg ml-1 de CdCl2. En un medio de cobre, el TMG fue de 3.5 y 3.67 días para concentraciones de 1 500 y 2 000 μg ml-1, respectivamente.
El análisis multivariado de varianza (Manova) reveló que Bradyrhizobium sp. (Lotus) impactó significativamente la velocidad de germinación (p= 0< 0.05).
En ausencia de Bradyrhizobium sp. (Lotus), la tasa de inhibición de la germinación fue del 100% cuando se aplicó cobre o cadmio por separado, independientemente de la concentración de iones, contrastando con la tasa cero observada en el control. La tasa de inhibición más baja se observó en la concentración C1 de la mezcla de cobre-cadmio (90%), con un aumento del 5% proporcional a la concentración. La tasa alcanzó un máximo del 80% para la concentración de cobre C1 y disminuyó al 70% con el aumento de la concentración.
Para el cadmio, la tasa de inhibición fue más baja al 40% para la concentración C1, aumentando al 60% en la C3. La mezcla de cobre y cadmio mostró una tasa de inhibición del 60% en C1, aumentando a un 70% comparable con el cobre solo. A pesar de estas variaciones, las tasas de inhibición fueron notablemente más bajas que las de las pruebas no inoculadas con Bradyrhizobium sp. (Lotus). El análisis multivariado de varianza (Manova) demostró que Bradyrhizobium sp. (Lotus) influyó significativamente en la tasa de inhibición de la germinación (p= 0< 0.05).
Se ha demostrado en resultados previos que el cobre y el cadmio y su combinación, ejercen a diferentes concentraciones, un efecto depresivo sobre la germinación de las semillas. Esta inhibición puede ser osmótica y tóxica. Si es de origen osmótico, deberíamos esperar una reanudación de la germinación después de levantar esta restricción. Sin embargo, si se producen fenómenos de toxicidad iónica, podemos esperar una falta de reanudación de la germinación. En particular, observamos la ausencia de reanudación de la germinación del trébol, independientemente del pretratamiento metálico y bacteriano. Esto confirma que la acción de los MT es de naturaleza tóxica.
Para probar mejor el efecto osmótico o tóxico de los MT sobre el trébol, comparamos el comportamiento de la germinación en medio metálico y en manitol. La interacción Trébol vs Manitol fue significativa (binomial= 0.002< 0.05). Los porcentajes de germinación sobre manitol (100%) fueron superiores a los registrados a las diferentes concentraciones de MT (C1, C2 y C3) y esto a pesar de la presión osmótica que indica los efectos tóxicos de los iones metálicos (Figura 2).
Sin Bradyrhizobium sp. (Lotus), la tasa de inhibición de la germinación (TI) varió de 0.9 a 1, mostrando un aumento del 5% proporcional a la concentración, sugiriendo interacciones antagónicas entre el cobre y el cadmio; la TI fue de 1, indicando una interacción aditiva entre los elementos.
La inoculación con Bradyrhizobium sp. (Lotus) redujo la tasa de inhibición entre un 13 y un 22% en comparación con los controles sin inoculación bacteriana. Esta reducción de la TI con Bradyrhizobium sp. (Lotus) indica una interacción antagónica para todas las combinaciones. En particular, hubo un cambio de aditividad a antagonismo entre el cobre y el cadmio en la concentración C3. El análisis multivariado de varianza (Manova) mostró que la preinoculación de semillas de trébol con Bradyrhizobium sp. (Lotus) condujo a respuestas significativamente diferentes en comparación con las pruebas no inoculadas (p= 0.02< 0.05) (Figura 3).
Bradyrhizobium sp. (Lotus) muestra una notable resistencia tanto al cobre como al cadmio. Las estimaciones in silico sugieren que la concentración inhibitoria mínima (CIM) para el cadmio es de aproximadamente 10 000 μg ml-1, mientras que para el cobre es de 2 000 μg ml-1 (Degaïchia et al., 2024). Esta alta tolerancia de Bradyrhizobium sp. (Lotus) a estos metales pesados lo posiciona como una solución prometedora para hacer frente a la contaminación ambiental causada por metales traza.
La tasa acumulativa y el porcentaje de germinación final de las semillas de trébol disminuyen con el aumento de la concentración de MT en el medio. De hecho, nuestros resultados ponen de manifiesto que el exceso de cobre y/o cadmio en el medio ambiente provoca una toxicidad irreversible. Lo mismo ocurre con la velocidad, la media y la cinética de la germinación. Estos resultados están alineados con los reportados por Mihoub et al. (2005); Lamhamdi et al. (2011).
Según estos autores, los MT (cobre, cadmio y plomo, etc.) en el medio inhiben significativamente la germinación de las semillas de algunas fabáceas. La inoculación de semillas de trébol con Bradyrhizobium sp. (Lotus) mejora significativamente la germinación bajo estrés metálico.
Según Nelson (2004), los rizobios pueden ejercer un efecto beneficioso sobre el crecimiento de las plantas al aumentar la tasa acumulativa de germinación y su velocidad. El efecto positivo de los rizobios sobre la germinación de semillas en ambientes desfavorables y la aparición del coleóptilo se atribuiría a la capacidad bacteriana para producir o modificar hormonas vegetales, incluidas las giberelinas, que juegan un papel clave en la germinación (Barassi et al., 2006).
Al analizar el impacto de los MT en multitud de funciones fisiológicas vitales de la planta, Ernst (1998) admite que la germinación es un proceso ciertamente vulnerable al estrés metálico, pero que sería uno de los más resistentes entre las otras fases del desarrollo de la planta.
Las barreras tegumentarias de las semillas evitarían una fuerte acumulación de oligoelementos metálicos. Además, para cualquier proceso fisiológico o metabólico, son los umbrales críticos de fitotoxicidad, definidos en términos de acumulación de tejidos, los que determinan la sensibilidad a los MT (Woolhouse, 1983; Fernandes et al., 1991).
La inhibición de la germinación es extremadamente pronunciada en los ensayos no inoculados. Esto se debe, como se ha explicado anteriormente, al efecto tóxico de los MT. Bradyrhizobium sp. (Lotus) induce una reducción significativa de esta inhibición.
Los resultados demuestran que la inoculación de Bradyrhizobium sp. (Lotus) mejora significativamente los parámetros de germinación en condiciones de estrés metálico. La inoculación aumentó el porcentaje total de germinación (TGA) y redujo la latencia de germinación inducida por el estrés por metales traza. Las semillas tratadas con Bradyrhizobium sp. (Lotus) exhibieron valores más altos de TGA y tiempos medios de germinación (TMG) más cortos en comparación con las semillas no tratadas, particularmente a concentraciones más altas de cobre y cadmio.
El uso de Bradyrhizobium sp. (Lotus) representa una estrategia prometedora para mejorar la germinación del trébol bajo estrés por metales traza, lo que indica el potencial de esta bacteria simbiótica para mejorar la tolerancia de las plantas a los elementos metálicos traza durante la germinación. Estos hallazgos proporcionan información valiosa para el desarrollo de prácticas agrícolas sostenibles destinadas a mitigar los efectos adversos del estrés metálico en la productividad de los cultivos.