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Los brotes o germinados son alimentos que han ido conquistando a los consumidores por su agradable frescura y se usan acompañando a diversos platos, tanto a nivel doméstico como en un gran número de restaurantes de todo el mundo. Además, representan un alimento de alta calidad nutricional, debido a que son fuente de minerales, vitaminas y compuestos bioactivos. La utilización de elicitores puede mejorar la calidad nutricional de estos alimentos. En este estudio se evaluaron cinco concentraciones (0, 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5 M) de ácido benzoico en germinados de lenteja (Lens culinaris L.). Se cuantificó la producción de biomasa, sólidos solubles totales, compuestos fenólicos totales, flavonoides totales y la capacidad antioxidante total. La elicitación con AB en bajas concentraciones mejoró significativamente la acumulación de MS y compuestos bioactivos; en cambio altas concentraciones redujeron significativamente estos parámetros. La elicitación con AB es una alternativa simple y eficiente para promover la producción de biomasa e inducir la biosíntesis de compuestos bioactivos en germinados de lenteja, para obtener alimentos funcionales.
Lens culinaris L., calidad nutricional, elicitores.
Los elicitores son sustancias de diversas fuentes tanto inorgánicos como orgánicas, que al ser aplicados de manera exógena en las plantas se desencadenan diversas modificaciones fisiológicas y se estimulan mecanismos de defensa de la planta ante estrés biótico o abiótico (Salifu et al., 2022). Los elicitores bióticos son todas aquellas sustancias generadas por organismos vivos, como proteínas, carbohidratos, bacterias, hongos y fitohormonas.
Por su parte, los elicitores abióticos son todos los estímulos físicos a los que son susceptibles las plantas, como la luz, la temperatura, señales eléctricas de larga distancia, ondas electromagnéticas, ondas de radiofrecuencia, percepción de estímulos mecánicos y emisiones acústicas, entre otros. Estas sustancias actúan como señalizadores de las plantas al inducir la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) que estimulan a la planta para la producción de mecanismos de defensa como hormonas, antioxidantes, enzimáticos y no enzimáticos, a fin de mitigar los efectos de las ERO (Da Silva et al., 2023).
El ácido benzoico (C7H6O2), es un es un ácido carboxílico aromático que tiene un grupo carboxilo unido a un anillo fenólico, se produce de manera natural en las plantas. Su aplicación exógena como elicitor produce un incremento en el contenido de compuestos bioactivos en las plantas y desempeña importantes funciones en la biosíntesis de compuestos fenilpropanoides, los cuales son precursores de una amplia gama de metabolitos primarios y secundarios como fenólicos y flavonoides (Tena et al., 2021).
Estos funcionan como antioxidantes celulares e inhiben ERO (Marchiosi et al., 2020) y previene la aparición de enfermedades degenerativas (Rai et al., 2021; Koza et al., 2022) ya que coadyuvan a mitigar el daño causado por el estrés oxidativo y la pérdida del sistema regulador antioxidante (Ahmed et al., 2022; Monib et al., 2023). Por otro lado, los germinados son una fuente de carbohidratos, fibra, vitaminas, nutrimentos esenciales y compuestos bioactivos, los cuales se han relacionado con la prevención y tratamiento de enfermedades (Lemmens et al., 2019; Ebert et al., 2022).
El proceso de germinación permite obtener granos con alta actividad biológica luego de la hidrólisis enzimática, posibilitando así la acumulación de compuestos bioactivos (Choque-Quispe et al., 2020), lo que mejora la actividad antioxidante (Pathan et al., 2022; Salifu et al., 2022). Las lentejas germinadas tienen mejores propiedades nutricionales al de las semillas (Bautista-Expósito et al., 2021; Rico et al., 2022).
El contenido de vitaminas, minerales, oligoelementos y enzimas pueden multiplicarse exponencialmente durante la germinación (Galieni et al., 2020). El consumo en fresco de germinados de lenteja aporta carbohidratos, fibra, vitaminas, nutrimentos y un alto contenido de compuestos fitoquímicos con efecto bioactivo como actividad antidiabética, antiinflamatoria, anticáncerigena, antihipertensiva y antioxidante (Hernández-Aguilar et al., 2020; Miyahira et al., 2021).
Dichas propiedades se deben a la acción de compuestos bioactivos, por lo que su incremento en germinados es una línea de investigación para la obtención de alimentos funcionales (Kumar et al., 2022). Los germinados cuentan con gran aceptación en el mercado, especialmente las personas que no pueden consumir alimentos de origen animal (Waliat et al., 2023). Suelen ser fáciles de digerir (Galanty et al., 2022; Ponce de León et al., 2022).
El empleo del AB durante el periodo de producción de germinados pudiera constituir una herramienta muy útil para potenciar la síntesis de compuestos bioactivos. En base a lo anterior el objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de la aplicación ácido benzoico en el contenido de compuestos bioactivos de compuestos en germinados de lenteja.
La investigación fue realizada en un laboratorio de biotecnología alimentaria de la Universidad Politécnica de Gómez Palacio, ubicada en la ciudad de Gómez Palacio, Durango. Se utilizaron semillas de lenteja de la empresa Aires de Campo con un porcentaje de germinación mínimo de 97%. Las semillas fueron pesadas en una balanza analítica (Ohaus Adventurer®) en proporción a 5 g, estas se sometieron a un lavado mediante inmersión en agua potable la cual contenía hipoclorito de sodio (NaClO) a una concentración de (1 ml L-1), a temperatura de (18 °C) durante 15 min para eliminar agentes nocivos que pudiera contener, las semillas fueron enjuagadas con agua potable dos veces para eliminar el exceso de NaClO; asimismo, se dejaron escurrir por dos minutos para minimizar el exceso de agua antes de la pregerminación, la cual consistió en la inmersión de la semilla en agua potable a 18 °C durante 6 h (Dziki et al., 2015).
La etapa de germinación consistió en colocar las semillas pregerminadas en la parte basal en charolas de poliestireno (15 x 10 x 5 cm) espumado en papel germinador (Tlymopukt®), con perforaciones en la parte basal para permitir suficiente aireación y evitar proliferación de agentes nocivos; estas charolas se colocaron en oscuridad a temperatura ambiente (20 °C) durante de 6 h. Después de este tiempo, inició la etapa de crecimiento, la cual consistió en colocar las charolas en estantería con iluminación natural durante seis días.
Se realizaron riegos con agua destilada en la etapa de germinación y crecimiento cada 3 h mediante aspersión con una dosis de 5 ml por aplicación. Los tratamientos fueron aplicados en el mismo riego y consistieron en la aplicación de C7H6O2 (Sigma-Aldrich, USA, al 99%) en las siguientes concentraciones; 0, 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5 M. El diseño experimental utilizado fue un completamente al azar con nueve repeticiones por tratamiento.
Para la evaluación de los tratamientos, se midieron las siguientes variables porcentajes de materia seca (MS), sólidos solubles totales (SST), contenido de compuestos fenólicos totales (CFT), flavonoides totales (FT) y capacidad antioxidante total (CAT). La materia seca se determinó siguiendo la metodología a AOAC (1990). Para la determinación de los sólidos solubles totales (SST), se pesaron 2 g del germinado, se maceraron en un mortero con pistilo y se colocaron unas gotas del macerado en el prisma de un refractómetro manual (Atago Master 53M).
Para la obtención de extractos se mezclaron 2 g de muestra fresca en 10 ml de etanol al 80% en tubos de vidrio con tapa de rosca, los cuales fueron colocados en agitador rotatorio (ATR Inc., EE. UU.) durante 24 h a 20 rpm a 5 °C. Los tubos fueron centrifugados luego a 3 000 rpm durante 5 min, el sobrenadante fue extraído para su posterior análisis.
Compuestos fenólicos totales: el contenido fenólico total se determinó por el método de Folin-Ciocalteau (Sariñana-Navarrete et al., 2021). Las muestras se cuantificaron en un espectrofotómetro ultravioleta UV-Vis a 760 nm (GENESYS 10S UV-Vis, Thermo Fisher Scientific, Inc., MA, EE. UU.). El patrón se preparó con ácido gálico. Los resultados se expresaron en mg GAE 100 g-1 peso fresco (PF).
Flavonoides totales: los flavonoides totales se determinaron por colorimetría (Sariñana-Navarrete et al., 2021). Las muestras se cuantificaron en un espectrofotómetro UV-Vis a 510 nm (GENESYS 10S UV-Vis, Thermo Fisher Scientific, Inc., MA, EE. UU.). El patrón se preparó con quercetina disuelta en etanol absoluto (y= 0.0122x-0.0067; r2= 0.965). Los resultados se expresaron como mg QE 100 g-1 PF.
Capacidad antioxidante total: la capacidad antioxidante total se midió mediante el método in vitro DPPH+ (Brand-Williams et al., 1995). Las muestras se cuantificaron en un espectrofotómetro UV-Vis a 517 nm (GENESYS 10S UV-Vis, Thermo Fisher Scientific, Inc., MA, EE. UU.). El estándar se preparó con Trolox (0.1-1 mM, r2= 0.998). Los resultados se expresaron como μM Trolox equivalente 100 g-1 PF.
Para cumplir con los supuestos de normalidad y homogeneidad de las varianzas de los datos del porcentaje de materia seca estos se trasformaron mediante arcoseno y posteriormente los resultados obtenidos fueron sometidos a un análisis de varianza de clasificación simple y comparación múltiple post hoc de medias mediante la prueba Tukey HSD a una probabilidad de 5%, con el software SAS v 9.0
El uso del AB provocó diferencias significativas en el contenido de MS en los germinados de lenteja (Figura 1). La concentración de 10-2 M superó 8% al tratamiento control y la concentración de 10-5 M la disminuyó en 10%. Los resultados indican que la aplicación de AB en altas concentraciones provoca un decremento en la acumulación de materia seca en los germinados como respuesta al estrés, como lo reportaron (Salas-Pérez et al., 2016).
Estos investigadores indican que dosis altas de elicitores causan un estrés ocasionando decremento en la división celular y en la síntesis de auxinas o citoquininas. Diversas investigaciones muestran el efecto del AB en altas concentraciones como el estudio de Valdez-Sepúlveda et al. (2015), reportan que el AB en altas dosis disminuyó la acumulación de biomasa fresca en Solanum lycopersicum. Prado et al. (2012), indican que la aplicación de AB disminuyó la acumulación de biomasa fresca en (Lactuca sativa).
Por lo que dicho efecto podría atribuirse a que el AB interactúa en la actividad metabólica de la semilla e inhibe ciertos procesos fisiológicos y translocación de metabolitos que interfieren en el crecimiento. Por otro lado, se ha reportado que en dosis bajas de elicitores como el AB induce la resistencia de las plantas contra los patógenos mediante la activación de señales que mejoran la producción de metabolitos secundarios (Marchiosi et al., 2020) y participa en cascadas de señalización en el desarrollo que controla el proceso del crecimiento (Abdul et al., 2020; Cherepanov y Zhuravleva, 2021).
Los SST en los germinados de lenteja mostraron diferencias entre las distintas concentraciones de AB utilizadas, los valores obtenidos fluctuaron entre 9 y 12 °Brix. La concentración de 10-2 M superó 27% al tratamiento control y la concentración de 10-5 M disminuyó 19% respecto a la concentración de 10-2 M. El cambio observado en los SST indica que el AB tiende a modificar el estado fisiológico de los germinados, debido a la translocación y acumulación de metabolitos en el tejido, pudiendo provocar una mayor concentración de almidón en glucosa (Salas et al., 2018).
Lo anterior, es debido a que cuando el AB ejerce una red que involucra vías paralelas y que se cruzan distribuidas a través de múltiples compartimentos subcelulares permitiendo a los compuestos volátiles de benzoílo (derivado de BA), bencilo (derivado del alcohol bencílico) y antraniloílo (obtenido del ácido antranílico) funcionar como compuestos de aroma y sabor (Widhalm, 2015).
Por otro lado, se han obtenido diversos estudios que han demostrado que el uso de elicitores en bajas concentraciones causan un incremento en los SST, debido a que su uso causa una estimulación y acumulación de la síntesis de metabolitos (Luo et al., 2020; Saravanakumar et al., 2022). Esto se examinó en germinados de Chenopodium quinoa Willd, Triticumspp. (Salas-Pérez et al., 2018), Solanum nigrumL. (Bano et al., 2019), Papaver rhoeasL. (Senila et al., 2020), Cucumis sativus L. (Cherepanov y Zhuravleva, 2021) y Lens culinarisL. (Debeski et al., 2021).
Por el contrario, en dosis altas de AB se afecta el metabolismo del vegetal desequilibrando el flujo de electrones a través de la cadena de transporte de electrones, provocando la producción de radicales superóxido y oxígeno singulete (Benincasa et al., 2019). Esto probablemente a la sobre exposición del elemento que emite estrés de alta intensidad, lo que provocó alteraciones del sistema fisiológico del germinado ya que, durante la imbibición de semillas, la generación controlada de ERO está involucrada en la percepción y transducción de las condiciones ambientales que controlan la germinación (Bailly, 2019).
Con relación a los compuestos bioactivos, se demostró que AB puede actuar como agente inductor de procesos metabólicos ya que pueden incrementar el contenido de compuestos bioactivos destacado en el desarrollo y efecto estimulante de la producción de metabolitos secundarios (Waqas et al., 2019; Marchiosi et al., 2020). Los resultados mostraron que el uso del AB causa diferencias en los compuestos fenólicos y flavonoides, así como, la capacidad antioxidante (Figura 2) en los germinados de lenteja.
Las dosis bajas de AB, aumentaron 28 y 24% el contenido de los fenóles y flavonoides respecto al control, lo que corroboró el efecto positivo del AB sobre los germinados de lenteja. Dichos resultados pueden atribuirse a que las bajas concentraciones de AB inducen componentes metabólicos que realizan funciones críticas en las plantas (Widhalm et al., 2015; Del Mondo, 2021). Alterando de forma significativa la composición bioquímica y la funcionalidad de brotes y semillas de leguminosas (Fouad et al., 2015; Debeski et al., 2021).
El contenido de compuestos fitoquímicos en las plantas depende de las condiciones de crecimiento estresantes (Ramírez-Estrada et al., 2016; Gaikwad et al., 2022; Kumar et al., 2023). En los últimos años, se han publicado informes sobre los efectos de varios elicitores en la composición de los germinados (Benincasa et al., 2019; Cherepanov y Zhuravleva, 2021).
Asimismo, se ha demostrado que remojar semillas en soluciones que contienen compuestos de ácidos orgánicos en bajas concentraciones aumenta el contenido de compuestos fenólicos en brotes de leguminosas (Dębski et al., 2021) y de compuestos fenilpropanoides en germinados de Triticum (Salas-Pérez et al., 2018). La utilización del AB durante la germinación de las semillas es una alternativa para incrementar la actividad de las enzimas antioxidantes y el contenido de compuestos fenólicos y por ende los flavonoides (Valdez-Sepúlveda et al., 2015; Sachdev et al., 2021).
El AB puede conducir a la síntesis de H2O2 (Wildermuth et al., 2006; Godoy et al., 2021; Dias et al., 2021), incrementando también la síntesis de enzimas de defensa de las plantas, como son los polifenoles, flavonoides y fitoalexinas (Sharma et al., 2019; Liu et al., 2021) mejorando las respuestas de defensa ante el estrés biótico y abiótico (Nabavi et al., 2020; Aloo, et al., 2021).
El uso de elicitores puede ser una alternativa viable para mejorar la calidad nutricional de los germinados (Ramírez-Estrada et al., 2016; Benincasa et al., 2019); sin embargo, es difícil precisar los efectos del AB en el contenido de los compuestos bioactivos de los germinados ya que depende de las condiciones de crecimiento estresantes, la especie vegetal, las etapas de crecimiento, la dosis y a la exposición de estos (Kapoor et al., 2020).
Con relación a la capacidad antioxidante, las diferentes concentraciones de AB provocaron diferencia significativa en los germinados de lenteja, se obtuvieron valores comprendidos entre 98 y 115 μM equiv Trolox 100 g-1 PF (Figura 2c). La mayor capacidad antioxidante se presentó en los germinados de Triticum con concentración de 10-2 M, mientras que las concentraciones altas y el tratamiento control presentaron la menor actividad antioxidante.
Las concentraciones altas de AB resta la capacidad antioxidante de los germinados de lenteja. Altas dosis de AB pueden causar estrés oxidativo y disminuir la biosíntesis de antioxidantes (Deng et al., 2017), debido a la alta producción de especies ERO a través de la vía del shiquimato/corismato y de la fenilalanina Phe (Valdez-Sepúlveda et al., 2015).
Lo anterior explica los motivos por los que el AB modifica el crecimiento, la tolerancia al estrés, la anatomía y morfología de especies vegetales (Yoo, et al., 2013), ya que los elicitores en altas concentraciones generan una ruptura de la función celular normal, además de daño fisiológico y morfológico en diferentes macromoléculas, causando daños irreversibles de lípidos, ácidos nucleicos y proteínas celulares (Marchiosi et al., 2020; Aguirre-Becerra et al., 2021).
La aplicación de ácido benzoico mejora la calidad nutrimental de los germinados de lenteja. Concentraciones bajas de ácido benzoico incrementa de manera significativa la producción de biomasa, solidos solubles totales, así como los compuestos bioactivos; en cambio, concentraciones altas causan un efecto negativo.
La aplicación de ácido benzoico en bajas concentraciones induce el metabolismo secundario en la etapa germinativa y es eficaz para estimular la biosíntesis de compuestos bioactivos, ampliando así las posibilidades del uso de alimentos funcionales como una alternativa para incrementar la calidad nutritiva en el germinado de lenteja.
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