elocation-id: e3613
El ambiente influye en la composición química del aceite esencial de las plantas y también con su efecto biológico. El propósito del estudio fue: describir el perfil químico del aceite esencial de Tagetes lucida y evaluar el efecto biológico in vitro contra B. cinerea. El estudio se realizó en Texcoco, México durante octubre de 2021. Por hidrodestilación se obtuvo aceite esencial de plantas en floración; la identificación de compuestos químicos se realizó mediante la técnica GC-MS. Para el bioensayo in vitro se empleó el método de agar envenenado y micelio de B. cinerea de tres días de crecimiento. Se evaluaron doce tratamientos: aceite esencial 0.1, 0.5, 1 y 2%, Tween 20 al 0.1, 0.3, 0.5, 0.8, 1 y 2%, fungicida comercial y testigo absoluto (solo con agua bidestilada estéril). Cada 24 h se midió crecimiento radial del hongo con un vernier digital y se estimó la velocidad de crecimiento y la inhibición del crecimiento micelial. Se identificaron treinta y un compuestos químicos, (1S)-(-)-β-Pineno (36.4%), 1, 3, 5, 7-Ciclooctatetraeno (12.7%), eucaliptol (10.6%) y o-Cimeno (6.1%). Con las concentraciones de 0.1, 0.5, 1 y 2% se inhibió el crecimiento micelial y la esporulación de B. cinerea. El fungicida comercial y la concentración del 2% inhibieron totalmente el crecimiento del hongo. Tween 20 también inhibió el crecimiento micelial. La CL50 fue de 0.06% y la CL95 fue de 1.69%. La abundancia de terpenos en el aceite esencial de T. lucida mostró efecto fungicida contra B. cinerea. El surfactante tuvo efectos menores.
Tagetes lucida, B. cinerea, aceite esencial.
El Yiahutli, pericón o hierba de Santa María (Tagetes lucida Cav.) es una planta con distribución en zonas templadas y transicionales, en altitudes de 1 400 a 2 800 m. (Serrato, 2014), crece en vegetación de pino, encino, pino-encino y bosque latifoliado (Turner, 1996). Su altura es de 40 cm hasta 1.8 m, su floración inicia a mediados de agosto hasta octubre (Serrato, 2014).
El actual conocimiento tradicional sobre T. lucida revela diversos usos: como relajante en situaciones de cáncer, limpieza de heridas por cesárea, remedio contra picadura de alacrán y de serpiente, para disminuir dolor reumático, controlar garrapatas en aves, suavizar el efecto de la resaca, aromatizar ropa lavada, eliminar huevos de piojos y de pulgas, elaborar alcohol de caña con sabor de anís y saborizante de varios alimentos (Serrato, 2014). Tiene efecto biocida contra patógenos que afectan a humanos (Céspedes et al., 2006; Torres-Martínez et al., 2022) y otros efectos biológicos contra nematodos (Omer et al., 2015) y algunos hongos fitopatógenos (López et al., 2018).
Todos estos efectos se atribuyen a los compuestos químicos que contiene T. lucida tales como: terpenoides, cumarinas y flavonoides (Gutiérrez et al., 2018). En el aceite esencial se han detectado alrededor de 40 a 44 metabolitos secundarios, de la clase de monoterpenos, sesquiterpenos y fenilpropanoides (Regalado et al., 2011; Zarate-Escobedo et al., 2018), lo que significa una amplia variabilidad en tipos y cantidad de moléculas. En el aceite esencial de T. lucida la abundancia de monoterpenos y fenilpropanoides se relaciona con la variabilidad climática y del suelo (Zárate-Escobedo et al., 2018).
En los estudios realizados con aceite esencial de T. lucida contra hongos se usaron poblaciones vegetales de climas templado frío y semifrío (Céspedes et al., 2006; Barajas et al., 2011; López et al., 2018) en las que los fenilpropanoides (anetol y estragol) son componentes mayoritarios y los responsables de efectos biológicos contra hongos.
El aceite de T. lucida que tiene esa procedencia inhibe el crecimiento micelial, la esporulación y formación de esclerocios en Sclerotium rolfsii y Monilinia fructicola (Barajas et al., 2011). También, inhibe el crecimiento micelial de Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Penicillium janthinellum y Rhizoctonia solani (López et al., 2018). En el clima cálido los metabolitos secundarios en el aceite esencial corresponden mayoritariamente a terpenos (Zárate-Escobedo et al., 2018). Por ello, la evaluación del efecto biológico del aceite esencial de esta especie crecida en clima templado cálido es importante.
La variación en la composición química de aceites esenciales depende de diversos factores, entre ellos, genéticos, así como ambientales (Acero-Godoy et al., 2019). Por lo tanto, los estudios toxicológicos con el aceite de T. lucida deben considerar las características del hábitat en el que se desarrollan las poblaciones de esta especie en forma natural.
La evaluación de terpenos de T. lucida en el crecimiento fúngico complementará la información disponible sobre los efectos fúngicos de los fenilpropanoides que contiene la misma especie crecida en ambientes templados de subtipos fríos. La distribución de las poblaciones naturales de T. lucida en pisos altitudinales (Serrato, 2014), asociados con temperaturas que son contrastantes, representa una rica diversidad ambiental para T. lucida y también de biomoléculas.
Aunque varios aceites esenciales se han evaluado contra B. cinerea (Tančinová et al., 2022), el aceite esencial de T. lucida aún no se ha evaluado contra este hongo. El propósito de este trabajo fue describir el perfil químico del aceite esencial de T. lucida y evaluar el efecto biológico in vitro contra B. cinerea. Se espera que la composición del aceite esencial sea específica y que este aceite tenga efecto biológico contra el hongo fitopatógeno referido.
En octubre de 2021 se recolectaron muestras de Tagetes lucida Cav. en etapa de floración (tallos, flores y hojas) en el municipio de Pilcaya, Cacahuamilpa, Guerrero (18° 40’ 42.6” latitud norte 99° 32’ 31.3” longitud oeste), a 1 479 m de altitud y en clima templado con lluvias en verano (Cw1) (Köppen, 1948). El corte de tallos florales se hizo a 10 cm encima del suelo para evitar la pérdida de plantas en su hábitat, ya que esta es perenne y vuelva a retoñar. Especímenes de estas muestras se depositaron en el Herbario-Hortorio-JES ‘Jorge Espinosa Salas’ del Departamento de Preparatoria Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo, Estado de México (registro 35872).
En un destilador de cristal tipo italiano, con capacidad de 6 kg, se agregaron 2 L de agua potable, después, 2 kg de plantas frescas se metieron al matraz de balón previamente trituradas con tijera de poda; por un periodo de 45 min se hizo extracción de aceite esencial por hidrodestilación (Rodríguez et al., 2012). El aceite esencial se conservó en frascos de vidrio ámbar en refrigeración hasta su uso; se obtuvo 1.6 ml de aceite esencial por kilogramo de peso seco de tejido vegetal.
Con la técnica de microextracción en fase sólida (Zhao et al., 2022) se analizaron las muestras de aceite esencial; para ello, en un frasco ámbar se agregaron 5 µl de aceite esencial y se colocó una fibra de microextracción (PALsystem Ingenious Simple Handling) de fase sólida durante 1 min después, la muestra fue inyectada en un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas (GC-MS Agilent Technologies 7890 A GC System), se realizaron dos repeticiones y se utilizó una columna capilar GC column VF-5ms, de 30 × 0.25 (0.25).
La temperatura del horno de la columna se inició en 60 °C, posteriormente, a 120 °C durante 15 min y temperatura final de 230 °C. El incremento de la temperatura fue de 15 °C min-1, se usó helio como gas acarreador a un flujo constante de 0.5 ml min-1. La identificación de los compuestos se hizo al comparar el tiempo de retención y el espectro de masas con la biblioteca espectral NIST y corroborado con índices de Kovats y R match mayor a 800. Como referencias en el cálculo de los índices de Kovats se usaron n-alcanos.
La evaluación se hizo en medio de cultivo agar dextrosa y papa (PDA 39 g L-1) con el método de agar envenenado (Dikshit y Husain, 1984); se preparó una emulsión con 100 ml de agua bidestilada, 100 µl de Tween 20 y aceite esencial de T. lucida para obtener cuatro concentraciones (0.1, 0.5, 1 y 2% v/v). Por separado se prepararon seis concentraciones con Tween 20 (0.1, 0.3, 0.5, 0.8, 1 y 2% v/v) y se usó un fungicida comercial (1 g L-1): Cabrio C (Boscalid 25.2% + Pyraclostrobin 12.8%).
La esterilizaron fue durante 20 min en autoclave a 120 °C. Después, el medio PDA se vertió en cajas Petri de vidrio estériles de 90 mm. Transcurridas 24 h, se inoculó B. cinerea obtenido del Laboratorio de Resistencia Genética de la Universidad Autónoma Chapingo (UACH). La cepa de B. cinerea utilizada cuenta con identificación molecular con indicadores NL4 e ITS5HP (Toju et al., 2012) y registro GenBank PP401673.1.
El experimento se estableció con un diseño completamente al azar (DCA) con 12 tratamientos: cuatro concentraciones de aceite esencial, seis concentraciones de Tween 20, 1 g L-1 de fungicida Cabrio C (Boscalid 25.2% + Pyraclostrobin 12.8%) y un testigo, cada tratamiento con cinco repeticiones. Con un vernier digital se midió el crecimiento radial del hongo cada 24 h durante cinco días. Se evaluaron velocidad de crecimiento (VC) (Sinclair y Cantero, 1989) y la inhibición del crecimiento micelial (%I) (Kagezi et al., 2015).
En un microscopio estereoscópico se observó si se presentaba esporulación desde el quinto hasta el octavo día después de la siembra del hongo. Se utilizó una escala de medición nominal. Los datos se analizaron con pruebas de medias de Tukey (p≤ 0.05) mediante el software académico SAS (SAS Institute Inc, 2023). Con los resultados de las concentraciones de aceite esencial evaluada in vitro se determinaron las concentraciones Probit (CL50 y CL95) en software académico SAS (Finney, 1971; Castillo, 2007; SAS Institute Inc, 2023).
En el aceite esencial se identificaron treinta y un compuestos, cuatro de ellos mayoritarios: (1S)-(-)-β-pineno (36.4%), 1, 3, 5, 7-ciclooctatetraeno (12.7%), eucaliptol (10.6%) y o-cimeno (6.1%) (Cuadro 1), de todos los compuestos, los sesquiterpenos representaron el 40%, monoterpenos 30%, otros terpenos 3% y el resto correspondieron a alcoholes menos abundantes. Compuestos como estragol, anetol, metil eugenol (Bicchi et al., 1997), β-ocimeno, β-cubebeno, β-mirceno, germacreno, cariofileno, nerolidol (Regalado et al., 2011) y acetato de geranilo (Zarate-Escobedo et al., 2018) se han reportado como compuestos mayoritarios en T. lucida, lo cual significa que los metabolitos secundarios que resultaron mayoritarios en la población Pilcaya (Cuadro 1), distintos de los reportados previamente en otros estudios (Cuadro 2), amplían el conocimiento de la fitoquímica de esta especie.
Al comparar los compuestos encontrados en la población de estudio (Cuadro 1), denominada Pilcaya (1 479 msnm), con los encontrados por Zarate-Escobedo et al. (2018) en la localidad denominada El Mogote-Pilcaya (1 493 msnm), ambos puntos cercanos, los compuestos mayoritarios en el aceite esencial de ambas poblaciones no coinciden (Cuadro 2). El compuesto (-)-β-pineno que, en Pilcaya presentó 36.4% de abundancia (Cuadro 1) en el Mogote-Pilcaya la abundancia fue 1.1% (Cuadro 2) (Zarate-Escobedo et al., 2018).
El sitio Pilcaya es más cálido, posiblemente en 2 °C y de menor altitud (1 479 m), respecto del sitio El Mogote-Pilcaya. En otras especies se ha registrado que la temperatura, régimen hídrico y otros factores influyen la síntesis de metabolitos secundarios (Karalija et al., 2022; Valkovszki et al., 2023). El resultado es valioso para seleccionar áreas de recolección y de posible cultivo, debido a la importancia que pueden tener los cambios en la temperatura y altitud en el tipo y cantidad de compuestos químicos.
En cuanto al efecto biocida del aceite esencial, se encontró que, con 1 y 2% se inhibió el crecimiento micelial de B. cinerea con diferencias estadísticas con respecto a la concentración de 0.1% (Cuadro 3) y no hubo esporulación del hongo. Por ello, la concentración de 1% es adecuada para verificar si el efecto observado a nivel in vitro también se podría reproducir a nivel in vivo con el debido cuidado de no conllevar efectos de fitotoxicidad.
[i] Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey, 0.05), CV= coeficiente de variación; DMS= diferencia mínima significativa; *= nivel de significancia (p( 0.05); TL2= aceite esencial 2%; TL1= aceite esencial 1%; TL0.5= aceite esencial 0.5%; TL0.1= aceite esencial 0.1%; FC= fungicida comercial Cabrio C.
El aceite esencial de T. lucida también inhibe a Penicillium notatum, Fusarium moniliforme, Fusarium sporotrichum, Trichophyton mentagrophytes (Céspedes et al., 2006), Sclerotium rolfsii y Monilinia fructicola (Barajas et al., 2011), Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Penicillium janthinellum y Rhizoctonia solani (López et al., 2018). En el presente trabajo por primera vez se presentan resultados contra B. cinerea (Cuadro 3). Se destaca el efecto biológico del aceite de T. lucida al 1% ya que estadísticamente iguala al fungicida comercial y con ello, se abren posibilidades técnico-económicas para analizar un posible aprovechamiento del mencionado recurso natural.
El efecto inhibitorio ocasionado por el aceite esencial contra hongos se debe a que causan daños en la membrana citoplasmática, interrumpen varias capas de polisacáridos, ácidos grasos y fosfolípidos (Helal et al., 2006; Rammanee y Hongpattarakere, 2011). También, dañan las hifas, vacuolaciones, fuga de protoplastos o destrucción mitocondrial (Rasooli et al., 2006). Soylu et al. (2010) revelan alteraciones morfológicas en las hifas de B. cinerea causadas por la aplicación de aceites esenciales de Origanum syriacum, Lavandula stoechas y Rosmarinus officinalis.
El tratamiento con Tween 20 (2%) mostró inhibición de 24.02% (Figura 1) con una velocidad de crecimiento del micelio de 6.51 mm d-1, mientras que con la menor concentración (0.1%) la inhibición fue de 5.15% y la velocidad de crecimiento se incrementó a 8.03 mm d-1 (Cuadro 3); las concentraciones 0.1, 0.5, 0.8 y 1% que se probaron del surfactante, no fueron estadísticamente diferentes al testigo.
Aparentemente, el efecto de Tween es antifúngico dependiente y podría estar relacionado con la solubilidad del antifúngico en el medio utilizado; por ello, es importante estandarizar la concentración de surfactante para su uso en la preparación del inóculo o al hacer la emulsión con la finalidad de asegurar resultados confiables (Gómez-López et al., 2005), ya que se ha observado que Tween 20 (0.1%) inhibe la germinación de conidios de Beauveria bassiana en un 20% (Mwamburi et al., 2015). En el presente experimento, el uso de Tween 20 al 0.1% prácticamente no tuvo efecto inhibitorio. Sin embargo, las concentraciones mayores (>0.1%) si inhibieron a B. cinerea.
En los tratamientos con aceite esencial y con fungicida comercial, no hubo esporulación de B. cinerea (Figura 1), mientras que, en el testigo y el tratamiento con Tween 20 hubo esporulación hasta el octavo día, lo que refuerza la actividad biológica que tiene el aceite de T. lucida que se evaluó.
Con la aplicación in vitro de aceites esenciales de Thymus vulgaris, Origanum vulgare, Origanum dictamus y Origanum majorana también se disminuyó la producción y germinación de conidios en Penicillium digitatum (Daferera et al., 2000). El efecto antiesporulante en Aspergillus fumigatus se relacionó con la actividad inhibidora de la respiración debido al efecto de los aceites esenciales (Inouye et al., 1998)
Las concentraciones Probit del aceite esencial de T. lucida proveniente de Pilcaya, fueron de 0.06% (v/v) para CL50 y de 1.69% (v/v) para CL95 (Cuadro 4), referencias que permiten sugerir que el aceite de T. lucida es una sustancia vegetal candidata para el biocontrol de B. cinerea. En perspectiva se contempla la evaluación in vivo del mejor tratamiento considerando la referencia del análisis Probit, así como verificar el efecto biológico de cada compuesto mayoritario.
| Aceite esencial (v/v) | Concentraciones letales | Límites de confiabilidad (95%) |
|---|---|---|
| T. lucida | CL50 0.06 | 0.02704-0.09868 |
| CL95 1.69 | 1.07514-3.5546 |
Las poblaciones naturales de T. lucida en Pilcaya, Cacahuamilpa, Guerrero, son abundantes y constituyen un recurso natural promisorio para su aprovechamiento sustentable a nivel de las comunidades propietarias de esas tierras, sobre todo si la exploración sobre efectos biológicos se amplía a plagas insectiles, diversos hongos fitopatógenos, ácaros, bacterias y otros organismos de importancia en medicina humana y veterinaria, arrojará resultados favorables.
Desde luego, conviene evaluar la viabilidad financiera del proceso de destilación del aceite para tener un panorama real del potencial de aprovechamiento del recurso fitogenético en cuestión. Hay que considerar que el rendimiento de 1.6 ml se obtiene de 1 kg de tejido seco, entonces para lograr la obtención de 1 L de aceite se ocuparía 625 kg de tejido seco, lo que equivaldría aproximadamente a un volumen de 5 t de planta fresca, un escenario que orienta a reflexionar sobre posible manejo agroecológico de las poblaciones nativas o llevarlas a cultivo convencional.
El aceite esencial de T. lucida contiene treinta y un compuestos químicos. Los compuestos mayoritarios son terpenos y su abundancia se asocia con el clima templado cálido de donde proviene el material vegetal. El aceite esencial evaluado tiene efecto fungicida in vitro contra B. cinerea y validado con la evaluación Probit. Tween 20 inhibe el crecimiento de forma parcial, entonces, la cantidad de surfactante para disolver el aceite debe ajustarse.
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