Fusarium graminearum quimiotipo Don en grano de cebada maltera cultivada en México

La fusariosis de la espiga es una enfermedad de gran importancia económica en cereales de grano pequeño como la cebada (Hordeum vulgare L.). Esta enfermedad es ocasionada por un complejo de especies de Fusarium entre ellas Fusarium graminearum Schwabe (Teleomorfo Gibberella zeae (Schweinitz) (Mert-Türk et al., 2014). Gilchrist-Saavedra (2000) reportó la presencia de la fusariosis de la espiga en México, en regiones de Valles Altos y del Bajío. Estas regiones comprenden los estados de Hidalgo, Estado de México, Puebla y Tlaxcala y los de Guanajuato, Jalisco y Michoacán, donde se cultiva cebada maltera bajo condiciones de temporal y riego, respectivamente.

F. graminearum es un hongo que se caracteriza por producir toxinas que dañan la salud de animales y personas que consumen granos o productos de cebada contaminados (Bezerra et al., 2014; FDA, 2010), entre las que destacan las del grupo de los tricotecenos como el deoxinivalenol (Don) y el nivalenol (NIV) (Mert-Türk et al., 2014). Estas toxinas se consideran como un factor de virulencia asociado con la capacidad del hongo de producir aislamientos con diferente grado de patogenicidad (Mesterházy, 2002; Malihipour et al., 2012).

Entre las estrategias recomendadas de control de la fusariosis de la espiga se encontró el uso de variedades resistentes para disminuir la incidencia del hongo en el grano (McMullen et al., 2012). Por lo anterior, es necesario contar con una colección de cepas de F. graminearum, aisladas de las variedades y líneas experimentales de cebada maltera, cultivadas en las diferentes regiones geográficas de México, para identificar fuentes de resistencia que puedan ser utilizadas en cruzamientos realizados por los programas de mejoramiento genético de cebada de instituciones de investigación nacional e internacional para controlar la enfermedad (Bobadilla et al., 2019).

Este trabajo tuvo como objetivo principal aislar y caracterizar morfológica y molecularmente aislamientos de F. graminearum procedentes de diferentes regiones productoras de cebada maltera en México e identificar aquellas cepas con la mayor capacidad de producir toxina Don in vitro, para estudios posteriores de búsqueda de fuentes de resistencia genética a la fusariosis de la espiga.

Durante los ciclos 2021, 2022 y 2023 de producción de cebada maltera, se colectaron 257 muestras de espigas con y sin síntomas de manchado de grano de las variedades Adabella, Alina, Armida, Blanca, Esperanza y Esmeralda) y de 131 líneas experimentales del programa de Cebada del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). En la región de Valles Altos se colectaron 68 muestras (19 en Hidalgo, 16 en Tlaxcala, 17 en el Estado de México y 16 en Puebla); 19 en Baja California; 156 en el Bajío (136 en Guanajuato, 12 en Jalisco y 8 en Michoacán), y 14 en Tamaulipas. De cada muestra se tomaron al azar 240 semillas para su análisis por la prueba de papel secante y congelación (Warham et al., 1997).

Previo a la prueba, la semilla se desinfestó con hipoclorito de sodio (Reasol^MR) al 5% por 1 min en agitación mecánica, y se enjuagó dos veces con agua destilada estéril. Los aislamientos con características morfológicas de F. graminearum (Leslie y Summerell, 2006) se purificaron por cultivo monospórico en agua-agar (BD Bioxon^®), se cultivaron en agua-agar-hoja de clavel y papa-dextroxa agar (BD Bioxon^®) y se almacenaron en aceite mineral (Mier et al., 2002) y papel filtro Whatman #1 (Fong et al., 2000).

De cada aislamiento se extrajo ADN a partir de micelio liofilizado con el método de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) (Joint Research Centre of the European Commision, 2007). La calidad y cantidad del ADN extraído se verificó en un NanoDrop ND-1000. Para confirmar la identidad y determinar el quimio tipo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se establecieron reacciones con los iniciadores especie-específicos Fg16N-Forward ^5´ACAGATGACAAGATTCAGGCACA^3´ y Fg16N-reverse ^5´TTCTTTGACATCTGTTCAACCCA^3´ (Nicholson et al., 1998) y con los iniciadores, ToxP1 ^5′GCCGTGGGGRTAAAAGTCAAA^3′ y ToxP2 ^5′TGACAAGTCCGGTCGCACTAGCA³ los cuales amplifican una región intergénica entre los genes Tri5 y Tri6 relacionados con la síntesis de las toxinas Don y Niv (Li et al., 2005).

Cada reacción fue de un volumen final de 12 µl con la misma formulación, excepto para la alineación. Desnaturalización inicial 95 °C, 10 min; 40 ciclos: desnaturalización 95 °C, 30 s; alineación 60 °C, 60 s (Fg16N) o 65 °C, 60 s (ToxP); extensión 72 °C, 72 s; extensión final 72 °C, 10 min. Las reacciones se establecieron en un termociclador Eppendorf Mastercycler Gradiente Thermal Cycler, los productos se analizaron por electroforesis en agarosa al 2% y se visualizaron en un fotodocumentador UVP PhotoDoc-It^TM, Fisher Scientific. Como referencia se incluyó en el gel el marcador ØX174 (PhiX174) /HaeIII (Fermentas y BioLabs, respectivamente).

El producto de PCR con Fg16N de 21 cepas se envió a secuenciar a Macrogen CIA (http://dna.macrogen), Korea y las secuencias se compararon con Ncbi Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para verificar su relación con Fusarium graminearum. La capacidad de los aislamientos para producir Don in vitro se evaluó mediante la prueba de Ridascreen^® Fast Don (inmunoensayo enzimático (Elisa)) utilizando muestras de harina (2 g) obtenidas de grano de arroz (Sos^® Arroz Sushi, super extra) colonizado con el hongo, y con placas, reactivos y protocolo de Ridascreen^® Fast Don.

Los datos se analizaron con Statistical Analysis Software (SAS) Versión 9.4, para Windows, bajo un diseño completamente al azar, y la comparación de medias por el método de Tukey (α= 0.05). Del total de semilla (61 680 semillas) analizada de Valles Altos, Bajío y Tamaulipas, se obtuvieron 39 aislamientos con características morfológicas de F. graminearum (Leslie y Summerell, 2006) (Cuadro 1).

De la semilla de Baja California y Michoacán no se aisló el hongo. Con excepción de JA1, todos los aislamientos amplificaron la banda esperada de 280 pares de bases (pb) con Fg16N-F/Fg16N-R (Nicholson et al., 1998). Las secuencias (aproximadamente 250 pb) del producto con Fg16N de 21 cepas (tomadas al azar por localidad), incluyendo la de JA1, se alinearon con la secuencia del cromosoma 1 de F. graminearum, número de accesión HG970332, depositada en la base de datos del GenBank-NCBI (Cuadro 1). Los índices de similitud estuvieron entre 99 y 96%.

En la reacción con ToxP1/ToxP2, 17 aislamientos de Valles Altos (14), Jalisco (1) y Tamaulipas (2) amplificaron una banda de 300 pb (Cuadro 1). Es importante indicar que estos iniciadores detectan simultáneamente dos fragmentos: uno de 300 pb para el quimiotipo de F. graminearum productor de Don y otro de 360 pb para el quimiotipo de F. graminearum productor de NIV (Li et al., 2005). Ningún aislamiento de Guanajuato amplificó con estos iniciadores. Con excepción de NA11R30, 10 de los aislamientos que amplificaron con ToxP1/ToxP2 registraron producción de Don in vitro, observándose diferencias (Tukey α= 0.05) en los niveles de producción.

Posiblemente los aislamientos que amplificaron con Fg16N, pero que no amplificaron con ToxP ni registraron producción de Don, correspondan a otros quimiotipos de F. graminearum (Walker et al., 2001).

En general, los resultados indican que en las regiones productoras de cebada maltera de Valles Altos, Bajío, Baja California y Tamaulipas la incidencia de F. graminearum fue baja (menor a 1%), y que los 39 aislamientos obtenidos presentan variación genética (Tukey α= 0.05) no solamente entre los aislamientos provenientes de diferentes estados, sino entre los aislados en colectas de un mismo municipio (Cuadro 1). La investigación de Cerón-Bustamante et al. (2018) no detectó a F. graminearum entre las especies de Fusarium asociadas a espigas de trigo con fusariosis de la espiga, colectadas en las regiones productoras de trigo de Valles Altos, Bajío y Oaxaca.