Fuente inorgánica de selenio en el cultivo de callos de Catharanthus roseus L.

Catharanthus roseus, conocida también como vinca, es una especie herbácea perenne con un alto valor ornamental y cultural debido a su uso en la medicina tradicional. Esta especie es utilizada en distintas culturas alrededor del mundo para tratar diversos padecimientos como infecciones estomacales, gastritis o asma. También, se han reportado actividades anticancerígena, antioxidante, antiinflamatoria y antimicrobiana en los extractos de hojas y raíces (Das et al., 2020).

Además, diversos alcaloides producidos en esta especie, como la ajmalicina, la vinblastina y la vincristina, tienen actividades anticancerígenas (Dhyani et al., 2022). Existen productos farmacéuticos a partir de estos compuestos que generan más de 100 millones de dólares al año (Rojas-Sandoval, 2022). De este modo, el estudio de C. roseus ha ganado gran importancia en la investigación científica enfocada en la producción de fármacos que involucran a los metabolitos secundarios producidos por esta especie (Dhyani et al., 2022).

Aunque esta planta tiene altos rendimientos en su reproducción por semillas, es necesaria la propagación asexual para asegurar menor variabilidad genética y garantizar mayor homogeneidad del material vegetal en la producción a gran escala. Es necesario estandarizar las condiciones del cultivo como temperatura y fotoperíodo en regiones donde las especies no crecen de manera natural; así como, las concentraciones y los tipos de reguladores de crecimiento de acuerdo con la especie vegetal (Salas-Valdivia et al., 2023).

No obstante, la propagación tradicional no es recomendada para su producción a gran escala debido a bajas tasas de multiplicación (Rojas-Sandoval, 2022). Durante las últimas décadas, las tecnologías del cultivo in vitro han sido exploradas en C. roseus, donde destaca la producción de callos (Rahman et al., 2019).

Por otro lado, los callos se han estudiado en plantas debido a sus efectos positivos en diferentes especies vegetales. En el cultivo de células en suspensión de C. roseus se produjo una mayor cantidad de alcaloides como ajmalicina y serpentina cuando el medio de crecimiento tuvo alguna fuente de Se (Na₂SeO₃ o Na₂SeO₄), comparado con el testigo (Arvy et al., 1995). El Na₂SeO₃ mejoró el crecimiento de Calendula officinalis (L.), al aumentar la altura de plántula, el área foliar y el número de hojas (Hernández-Díaz et al., 2021). El Se, en forma de nanopartícula, tuvo un efecto bioestimulante en el desarrollo y en el rendimiento de la biomasa de C. roseus y de flores de C. officinalis (Garza‑García et al., 2023).

Las distintas fuentes de Se están asociadas a cambios en el desarrollo de las plantas, en la producción de metabolitos secundarios, en la tolerancia a distintos tipos de estrés, en el balance hormonal y en la eficiencia fotosintética, entre otros (Behbahani et al., 2020). Hay reportes que indican que concentraciones altas de Se pueden causar fitotoxicidad en distintas especies vegetales (Garza-García et al., 2023).

Por lo que, el efecto del Se en las plantas depende de la especie, la etapa de desarrollo y la fuente del selenio (León-Morales et al., 2019). El objetivo de este estudio fue inducir la formación de callo en distintos explantes de C. roseus, mediante la combinación de reguladores de crecimiento; así como, evaluar el efecto de dos fuentes inorgánicas de Se en el crecimiento de los callos para identificar el mejor intervalo de concentraciones.

Este trabajo se realizó en las instalaciones de la Unidad de Biotecnología Vegetal, sede Zapopan, del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ). Las semillas de C. roseus, variedad Mediterranean Burgundy Halo (BallSeed, USA), se desinfestaron superficialmente con hipoclorito de sodio (NaClO) comercial al 3% durante 8 y 12 min.

Posteriormente, las semillas se lavaron tres veces con agua destilada estéril durante 3 min. El 15 de marzo de 2022, las semillas se sembraron en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) 10% (con 3 g L^-1 de sacarosa y 8 g L^-1 de agar) y se mantuvieron en incubación a 25 °C. El porcentaje de germinación se determinó 10 días después del establecimiento del experimento.

Los explantes de hipocótilos y de hojas de las plántulas obtenidas en cultivo in vitro se colocaron en placas Petri con medio MS (30 g L^-1 de sacarosa, 8 g L^-1 de agar) y con los tratamientos con reguladores de crecimiento (Cuadro 1). En cada placa se colocaron cinco hojas y tres hipocótilos con un total de 10 repeticiones por tratamiento. Las placas se mantuvieron en incubación a 25 °C durante 40 días.

Para evaluar las diferentes concentraciones de Se, se realizaron subcultivos de los callos obtenidos, con el medio de cultivo del tratamiento 1 y se agregó 1, 10, 50 o 100 mg L^-1 de Na₂SeO₃ o Na₂SeO₄. Después de analizar los datos obtenidos del primer ensayo, se llevó a cabo un segundo experimento con un intervalo de concentraciones más estrecho (5, 10, 15 ó 20 mg L^-1 de ambas fuentes de Se) y el testigo.

En los dos experimentos, los callos se mantuvieron en incubación a 25 °C con un fotoperiodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad durante 60 días. La inducción de callo se determinó mediante imágenes fotográficas y se midió el área de cada callo, mediante el software ImageJ (Versión 1.53s, mayo de 2022).

El crecimiento se evaluó con el peso fresco de los callos, en una balanza analítica (BP121S, Sartorius, 120 g. Goettingen, Alemania). Se realizó un análisis de varianza y una comparación de medias con la prueba de rango múltiple de Duncan, en Statgraphics Centurion XV (StatPoint Inc., 2007), con un nivel de significancia de p≤ 0.05.

Se obtuvo 93% de germinación después de 10 días de la siembra, la germinación se determinó con la emergencia de la radícula. Con los dos tratamientos (8 y 12 min con NaClO) se tuvo el 95% de éxito en la desinfestación de las semillas. Se utilizó el tratamiento con 8 min para el establecimiento del cultivo in vitro.

Para la inducción de callos, en el tipo de explante utilizado (hipocótilos u hojas) no se encontró diferencias significativas (p= 0.3665). El factor regulador de crecimiento fue estadísticamente significativo (p= 0.0001) para el área de callos. Los tratamientos 1 y 3 generaron callogénesis, con un área promedio de callos de 0.72 cm² con el tratamiento 1, en ambos explantes. Con el tratamiento 2 no hubo formación de callos.

Con el tratamiento 3 se obtuvo 0.66 y 0.56 cm² en los callos obtenidos a partir de hipocótilos y de hojas, respectivamente. Se observaron diferencias a nivel cualitativo en los callos de los tratamientos 1 y 3 (Figura 1). La mezcla de reguladores de crecimiento utilizada en el tratamiento 1 estimuló la formación de callos blancos y friables (Figura 1a), estas características del material vegetal son adecuadas para el cultivo masivo de callos en placa o para el establecimiento del cultivo de células en suspensión.

Figura 1

Figura 1. Inducción de callo en C. roseus. a) callos obtenidos con el tratamiento 1 (3 mg L^-1 de 2,4-D, 2 mg L^-1 de BA y 2 mg L^-1 de NAA); y b) callos del tratamiento 3 (1.5 mg L^-1 de BA y 0.5 mg L^-1 de NAA).

Los resultados de este estudio coinciden con lo reportado por Rahman et al. (2019), quienes obtuvieron callos de C. roseus con características similares en explantes de hojas provenientes de plántulas crecidas ex vitro, en un medio de cultivo con 3 mg L^-1 de 2,4-D y 1 mg L^-1 de BA. Los callos del tratamiento 3 (Figura 1b) presentaron una consistencia compacta y de color verde, lo que puede deberse a la producción de clorofila, que después de 60 días se observaron procesos de organogénesis. Singh et al. (2011) generaron callos con características similares con 1.5 mg L^-1 de BA y 1 mg L^-1 de NAA.

Los callos con estas propiedades son útiles para la micropropagación debido al proceso de diferenciación observado (Das et al., 2020). Para determinar el efecto del Se en el crecimiento de los callos, sin inducir un proceso de diferenciación, se utilizaron los callos obtenidos con el tratamiento 1. El mejor crecimiento de los callos se obtuvo con 1 y 10 mg L^-1 de Na₂SeO₄ (0.52 y 0.53 g de peso fresco, respectivamente) y con 1 mg L^-1 de Na₂SeO₃ (0.5 g de peso fresco), estos resultados fueron superiores (p= 0.0001) al testigo (0.36 g).

Las concentraciones de Se más altas (50 y 100 mg L^-1) tuvieron un impacto negativo en el crecimiento de los callos (0.18 y 0.1 g con Na₂SeO₃ y con Na₂SeO₄ 0.3 y 0.07 g, respectivamente) (Figura 2).

Figura 2

Figura 2. Peso fresco de los callos cultivados con dos fuentes inorgánicas de selenio. Las letras sobre las barras indican diferencias significativas, mediante la prueba de rangos múltiples de Duncan con un nivel de significancia de p( 0.05.

En otros estudios con distintas especies vegetales se obtuvieron resultados semejantes, donde la aplicación de Se tuvo efectos positivos en el desarrollo de las plantas dentro de un intervalo específico de concentraciones (Garza-García et al., 2023). Sotoodehnia-Korani et al. (2020) reportaron mayor crecimiento de raíces y de hojas de Capsicum annuum con 0.5 y 1 mg L^-1 de Na₂SeO₄, mientras que, las plantas mostraron síntomas de toxicidad con dosis mayores a 10 mg L^-1.

Contrario a lo observado en C. roseus, ya que con 10 mg L^-1 de Na₂SeO₄ o Na₂SeO₃ se tuvo el mayor crecimiento de los callos. A su vez, Behbahani et al. (2020) reportaron mayor tamaño de hojas, de tallos y de raíces de Momordica charantia (L.), cultivada in vitro, al utilizar 1 y 4 mg L^-1 de Na₂SeO₄; no obstante, concentraciones superiores a 10 mg L^-1 disminuyeron el tamaño de las plántulas.

Los resultados obtenidos en el primer experimento permitieron plantear otro ensayo con un intervalo menor de concentraciones. En el segundo experimento, los callos con mayor peso fresco se obtuvieron con 5 y 10 mg L^-1 de ambas fuentes de Se (p= 0.0001). A partir de 15 mg L^-1 se apreció un descenso en el peso fresco de los callos, sin que fuera estadísticamente diferente al testigo (p= 0.2385) (Figura 3).

Figura 3

Figura 3. Peso fresco de los callos cultivados con dos fuentes inorgánicas de selenio. Las letras sobre las barras indican diferencias significativas, mediante la prueba de rangos múltiples de Duncan con un nivel de significancia de p( 0.05.

Además, se encontraron diferencias entre las fuentes de Se, el peso fresco de los callos cultivados con 50 mg L^-1 de Na₂SeO₃ fue estadísticamente inferior comparado con los callos crecidos a la misma concentración de Na₂SeO₄. Por lo que, el Na₂SeO₃ resultó más tóxico para los callos de C. roseus que el Na₂SeO₄. En otros estudios también se estableció un efecto comparativo entre el Na₂SeO₃ y el Na₂SeO₄.

En plantas de C. annuum, 5 µM de Na₂SeO₃ incrementó el peso fresco y seco de raíces, hojas y tallo, mientras que, 5 y 10 µM de Na₂SeO₄ resultaron con efectos similares en el crecimiento, al encontrar que C. annuum fue más tolerante al Na₂SeO₄. Aunque, ambas fuentes de Se tuvieron un impacto negativo con 20 µM de Na₂SeO₃ o de Na₂SeO₄ (Hernández-Hernández et al., 2018).

De forma similar, León-Morales et al. (2019) encontraron que 2.5 µM de Na₂SeO₃ o de Na₂SeO₄ mejoraron el porcentaje de germinación de C. annuum. No obstante, el crecimiento de la parte aérea fue superior únicamente en las plántulas que fueron tratadas con Na₂SeO₃. Mientras que, en Raphanus sativus (L.) no hubo diferencias significativas en la germinación o en el crecimiento de las plántulas con Na₂SeO₃ o Na₂SeO₄. El efecto del Se en las plantas depende de la fuente, de la concentración, de la especie y del tipo celular.