elocation-id: e3437
En México el género Lupinus, presenta una gran riqueza de especies y sus semillas generalmente muestran latencia. El objetivo fue evaluar el efecto de la escarificación química en dos medios de cultivo en semillas de tres especies de Lupinus. La investigación se realizó en el laboratorio de cultivo de tejidos del Campus Tabasco del Colegio de Postgraduados. Se emplearon tres tiempos (20, 30 y 40 min) de inmersión en ácido sulfúrico al 98%, semillas de tres especies de Lupinus L. campestris, L. exaltatus y L. montanus y los medios de cultivo MS y Gamborg con y sin Fe-EDTA. Las variables evaluadas fueron el porcentaje de germinación, longitud de raíz, longitud de tallo y número de hojas. Los resultados mostraron que hubo una interacción significativa entre los tratamientos evaluados, el tiempo de inmersión en el ácido sulfúrico influyó en la germinación de las semillas. El mayor porcentaje de germinación (83) se alcanzó en un tiempo de inmersión de 30 min para L. exaltatus. Mientras que, para L. campestris el porcentaje de germinación fue de 63 y para L. montanus de 12. En el medio de cultivo Gamborg con Fe-EDTA el porcentaje de germinación fue de 82 y sin Fe-EDTA de 72 para L. exaltatus, seguido por L. campestris y L. montanus. Las variables de crecimiento evaluadas mostraron valores altos en el medio de cultivo Gamborg sin la adición de Fe-EDTA, en su caso contrario las variables analizadas mostraron incrementos en los valores obtenidos. En el medio de cultivo MS con y sin Fe-EDTA los valores encontrados fueron menores comparados con el medio de cultivo Gamborg.
cultivo de tejidos, dormancia, escarificación, fabaceae.
El género Lupinus pertenece al orden Fabales, familia Fabaceae y tribu Genistae, ampliamente extendido a nivel mundial. Presenta una rica diversidad de especies que se dividen en dos grandes grupos: 13 especies del norte del Mediterráneo y dos en el este de África (Grether, 2005). No existe un número exacto de taxa de este género, Planchuelo (1999) indica alrededor de 1700 especies, aunque Clements et al. (2005) mencionan al menos 600. El género Lupinus L. incluye un dinámico grupo de especies caracterizadas por sus hojas palmaticompuestas y sus flores papilionadas en racimos terminales. La plasticidad para adaptarse a diferentes ambientes, la facilidad de sufrir cambios genéticos y la variabilidad fenotípica hace que la delimitación de especies sea una tarea muy difícil, que condujo a confusiones nomenclaturales (Planchuelo, 1999; Eastwood et al., 2008; Planchuelo, 2022).
En México, las especies silvestres de este género se distribuyen en la mayor parte del territorio nacional, con una alta concentración en la sierra Madre Occidental y el Eje Neovolcánico Transversal (Ruiz-López et al., 2006), donde existe una alta diversidad de especies (Bermúdez-Torres et al., 2009). El género está representado por plantas anuales, bianuales o perennes, herbáceas, arbustivas y arbóreas, con hojas alternas y estipuladas, generalmente palmado compuestas, de 4 a 17 folíolos (Wolko et al., 2010).
En su forma silvestre, todas las especies de Lupinus contienen alcaloides que son sustancias tóxicas que confieren sabor amargo al grano y a las partes verdes de las plantas (Mera, 2016), lo que llevó a la búsqueda de ejemplares sin alcaloides (Australian Government, 2013). Actualmente, cuatro especies se cultivan en diferentes partes del mundo (L. albus L., L. angustifolius L., L. luteus L. y L. mutabilis Sweet), cuyos granos representan una fuente importante de proteínas para alimentación humana y animal (Nuñez, 2021).
Las semillas de especies silvestres de Lupinus muestran latencia física, asociada al endurecimiento de la cubierta de la semilla, por lo que son impermeables, tanto al agua como al oxígeno (Rodríguez y Rojo, 1997; Pablo-Pérez et al., 2013; Sánchez-Soto et al., 2017). Generalmente, la germinación de semillas con testa dura es errática y las plántulas son frágiles, por lo que para su propagación es necesario conocer los factores que influyen en la latencia y germinación de estas semillas.
Para romper la latencia física en semillas, se emplea la técnica de escarificación que consiste en volver permeable la testa de la semilla para estimular la imbibición de agua (Medina-Sánchez y Lindig-Cisneros, 2005; Matoor et al., 2019). Entre los métodos más habituales están los que utilizan tratamientos químicos y los mecánicos. Los estudios relacionados con L. campestris, L. exaltatus y L. montanus, indican que la escarificación con ácido sulfúrico promueve la germinación, aunque la respuesta es variable dependiendo de la especie (Acosta-Perscástegui y Rodríguez-Trejo, 2005; Gutiérrez et al., 2010; Garduza-Acosta et al., 2020). Esta leguminosa se caracteriza por su elevado contenido en proteína, aceite y alcaloides, así como, fuente de proteína en alimentos para animales (Águila et al., 2018). Sin embargo, las especies del género Lupinus, tiene semillas de testa dura e impermeable a la humedad y oxígeno, por lo que requieren de tratamientos de escarificación para inducir el ablandamiento y con ello la germinación (Australian Govermment, 2013).
Por otro lado, el cultivo in vitro puede ser una herramienta importante para la multiplicación de especies de Lupinus, además de permitir contar con material aséptico de cultivos de células y tejidos in vitro, para estudios fisiológicos y agronómicos de estas especies. En L. montanus se ha observado que el cultivo del epicótilo en medio MS con 3 μM IAA y 1 μM BA ha mostrado el incremento del número de tallos, así como su altura (Ramírez-González et al., 2015). Por lo anterior el presente trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto de la escarificación química y dos medios de cultivo en semillas de tres especies de Lupinus.
La investigación se llevó a cabo en el laboratorio de cultivo de tejidos del Campus Tabasco del Colegio de Postgraduados. Vainas maduras de L. campestris Schltdl & Cham, L. montanus Kunt y L. exaltatus Zucc fueron recolectadas en los municipios de Chalchicomula de Sesma y Tlachichuca del estado de Puebla, México ubicadas a 19°04’ latitud norte; 97°19’ longitud oeste y una altitud de 3 442 m.
Las semillas fueron separadas de las vainas, secadas a temperatura ambiente y almacenadas aproximadamente durante tres meses a 4 °C en envases de plástico para el análisis de germinación. La Figura 1 muestra las semillas de las tres especies en estudio.
Previo a la aplicación de los tratamientos de escarificación, se evaluó el porcentaje de viabilidad de las semillas con el uso de cloruro de tetrazolio al 0.3% (Salazar-Mercado et al., 2020) para determinar la capacidad germinativa (viabilidad de las semillas). La escarificación se realizó con ácido sulfúrico (H2SO4) al 98%.
T0= testigo, T1=20 min de inmersión en ácido sulfúrico, T2= 30 min de inmersión en ácido sulfúrico, T3= 30 min de inmersión en ácido sulfúrico.
T0 + L. campestris T1 + L. campestris T2 + L. campestris T3 + L. campestris
T0 + L. exaltatus T1 + L. exaltatus T2 + L. exaltatus T3 + L. exaltatus
T0 + L. montanus T1 + L. montanus T2 + L. montanus T3 + L. montanus
Los medios de cultivo empleados fueron el (MS) propuesto por Murashige y Skoog (1962); Gamborg et al. (1968).
Gamborg + Fe-EDTA + L. campestris Gamborg + L. campestris
Gamborg + Fe-EDTA + L. exaltatus Gamborg + L. exaltatus
Gamborg + Fe-EDTA + L. montanus Gamborg + L. montanus
MS + Fe-EDTA + L. campestris MS + L. campestris
MS + Fe-EDTA + L. exaltatus MS + L exaltatus
MS + Fe- EDTA + L. montanus MS + L. montanus
Como agente gelificante se utilizó el Agar Agar® (Sigma) a razón de 5 g L-1. El pH se ajustó a 5.8. La esterilización se realizó en autoclave marca CV300 (fabricación nacional) a una temperatura de 121 °C y 1.2 kg cm-2 de presión, durante 15 min. Para la germinación, las semillas escarificadas en el medio de cultivo se colocaron en una cámara de crecimiento marca Thermo Scientific™ Precision™ modelo 818, programada a una temperatura de 20°,15 °C y con un fotoperiodo de 14 h luz y 10 h oscuridad.
Cada tratamiento de escarificación y crecimiento estuvo compuesto por 20 repeticiones (tubos de ensayo). En cada tubo se colocó una semilla. Los experimentos se replicaron tres veces. A los 15 días de cultivo se evaluó: el número de semillas germinadas y se expresó en porcentaje (%). A los 45 días de cultivo, se evaluaron la longitud de raíz (cm, medida con una regla de 30 cm), longitud de tallo (cm, medido con una regla de 30 cm) y el número de hojas.
Los experimentos se realizaron bajo un esquema de un diseño completamente al azar. Los datos experimentales de las variables evaluadas se procesaron estadísticamente mediante un análisis de varianza con arreglo factorial. La comparación de las medias se efectuó según rangos de Tukey (p≤ 0.05). Todos los análisis se realizaron con el software estadístico R Core Team versión 4.2.2. para Windows de Microsoft®
Los resultados mostraron diferencias estadísticas entre los tratamientos evaluados. La interacción fue significativa (p-value= 0.003), el tiempo de inmersión afectó la germinación de las semillas de las tres especies de Lupinus en estudio (Figura 2).
Las semillas de las tres especies de Lupinus en el tratamiento testigo (sin escarificar) mostraron bajos porcentajes de germinación. Para la especie L. campestris se obtuvieron porcentajes de germinación de 55, 63 y 60, a medida que se incrementó el tiempo de escarificación el porcentaje de semillas germinadas disminuyó.
Mientras que, para L. exaltatus los porcentajes de germinación fueron de 80, 83 y 52 en los tiempos de inmersión en ácido sulfúrico de 20, 30 y 40 min respectivamente. La especie L. montanus, mostró porcentajes de germinación de 12 y fueron los más bajos para los tres tiempos de inmersión.
Esto demuestra que el ácido logró reblandecer la testa dura de las semillas de las especies estudiadas permitiendo su permeabilidad, lo que influyó en la respuesta a la germinación de semillas de L. campestris y L. exaltatus las cuales presentaron los mayores porcentajes de germinación entre las especies evaluadas. En la Figura 3, se puedo observar que los embriones de las semillas en los tratamientos evaluados no presentaron daños.
La respuesta diferencial in vitro a la escarificación química de las semillas Lupinus estudiadas puede deberse a diferencias en la constitución de los tejidos que conforman la testa de esta especie, las condiciones que prevalecieron durante su maduración o la respuesta al medio de cultivo (Clements et al., 2005). Mediante la escarificación la semilla se agrieta y reblandece la cubierta, lo que permite la entrada de agua, oxígeno, luz y consecuentemente se activa la germinación (Medina-Sánchez y Lindig-Cisneros, 2005; Sánchez-Soto et al., 2017).
Los resultados obtenidos en semillas de L. montanus, difieren con los obtenidos por Acosta-Perscástegui y Rodríguez-Trejo (2005) en semillas de la misma especie, pero colectadas en el Parque Nacional Cumbres del Ajusco en México, DF a 3 200 msnm., donde con 15 min de exposición al ácido sulfúrico lograron el 100% de germinación en cajas Petri con papel húmedo. Mientras que, para L. campestrisGutiérrez et al. (2010) obtuvieron 50% de germinación con un tiempo de inmersión en ácido sulfúrico de 90 minutos, resultados inferiores a los alcanzados en esta investigación.
Para L. elegans Kunth, otra especie presente en México, se han observado porcentajes de germinación entre 88 y 91 cuando escarificaron las semillas con ácido sulfúrico en un tiempo de inmersión de 30 o 60 min (Medina-Sánchez y Lindig-Cisneros, 2005; Corona et al., 2007). En el caso de L. exaltatus, los porcentajes de germinación obtenidos fueron muy superiores a los de Garduza-Acosta et al. (2020), con el mismo ácido sulfúrico por 15 min. Pero la respuesta a la escarificación química, indica que las semillas de las diferentes especies de Lupinus silvestres estudiadas tienen testas duras o poco permeables, lo que influye en la latencia que presentan y limita su desarrollo agronómico (Pablo-Pérez et al., 2013).
Los resultados mostraron diferencias significativas (p-value= 0.019) en los tratamientos cuando se emplearon dos medios de cultivo Gamborg (B5) y Murashige y Skoog (MS) que contenían Fe-EDTA. Se alcanzaron porcentajes de germinación de 55, 82 y 31 de las semillas de L. campestris, L. exaltatus y L. montanus, respectivamente. Mientras que, en el medio de cultivo MS los porcentajes de germinación disminuyeron y fueron de 45, 37 y 9 para L. campestris, L. exaltatus y L. montanus, respectivamente (Cuadro 1).
| Medio de cultivo | Variedad | ||
|---|---|---|---|
| L.campestris | L.exaltatus | L.montanus | |
| MS-Fe | 45 | 37 | 9 |
| Gamborg-Fe | 55 | 82 | 31 |
En este estudio cuando a los medios de cultivo Gamborg (B5) y MS no se les adicionó el Fe-EDTA, el mejor porcentaje (72) de germinación fue para L. exaltatus en el medio de cultivo Gamborg. Sin embargo, las semillas de L. campestris y L. montanus obtuvieron mejor respuesta en el porcentaje de germinación de 56 y 28, respectivamente en el medio de cultivo MS sin adición de Fe-EDTA comparado con el medio de cultivo Gamborg bajo las mismas condiciones (Cuadro 2).
| Medio de cultivo | Variedad | ||
|---|---|---|---|
| L.campestris | L.exaltatus | L.montanus | |
| MS-Fe | 56 | 53 | 28 |
| Gamborg-Fe | 54 | 72 | 18 |
La menor respuesta de las especies evaluadas al medio MS, puede deberse a que este medio presenta unos de los potenciales osmóticos más negativos (Cárdenas y Villegas, 2002), lo que dificulta la entrada de agua a la semilla. Este efecto osmótico y tóxico por la presencia de sales puede inhibir la germinación. La presencia de sales en el medio disminuye el potencial hídrico, provocando una menor disponibilidad de agua para las semillas de manera que estas deben generar suficiente potencial osmótico para mejorar el estatus hídrico de los embriones y permitir su crecimiento (Goycokic y Saavedra, 2007).
El estrés osmótico también podría potenciar la síntesis de ABA que es uno de los principales causantes de la latencia en semillas (Raghavendra et al., 2010). En el caso de la respuesta de L. montanus al medio MS con adición de Fe, podría deberse a una menor tolerancia de esta especie a una mayor acumulación de iones del medio MS en comparación con el de Gamborg, ya que al eliminarle el EDTA-Fe, se observó un incremento en el porcentaje de germinación de esta especie.
Las semillas de L. montanus contienen 73.7 mg L-1 de Fe (Pablo-Pérez et al., 2013) y las especies y genotipos de altramuz difieren en su germinación y crecimiento en respuesta a variaciones del pH y al contenido de microelementos en el medio de cultivo (Tang et al., 1992; Sánchez-Soto et al., 2017). Una baja germinación en MS también se ha observado al compararlo con otros medios basales que difieren en su composición y de menor concentración de sales tales como WPM, Anderson y White’s (Bueno et al., 2009).
Por ejemplo, los valores de máxima germinación de los medios que contienen MS sugieren que la germinación de U. molinae Turkczaninou es muy sensible a la presencia de sales en el medio, el efecto inhibidor de este medio de cultivo se evidencia incluso en bajas concentraciones como utilizar un ⅛ del medio de cultivo MS (Rodríguez et al., 2014). En lo que respecta a las variables de crecimiento los resultados mostraron diferencias estadísticas significativas (p-valor= 0.0018< α para la variable longitud de raíces, en el caso de la variable número de hojas, se obtuvo un p- valor= 0.0126 < α y para longitud de tallos p-valor= 0.0197< α).
Cuando el medio de cultivo MS contenía Fe-EDTA, la longitud de raíces, longitud de tallo y número de hojas disminuyó en las tres variedades evaluadas. Mientras que, cuando el medio de cultivo no contenía Fe-EDTA las variables evaluadas incrementaron sus valores en las tres variedades L. campestris, L. exaltatus y L. montanus (Figura 4).
En la Figura 5 se pueden observar las diferencias en el crecimiento de las tres variedades de Lupinus evaluadas cuando el medio de cultivo MS estaba con (izquierda) y sin (derecha) de Fe-EDTA.
Para las variables de crecimiento, se obtuvieron diferencias estadísticas significativas en el medio de cultivo Gamborg (Figura 6). Cuando el medio de cultivo contenía Fe-EDTA la respuesta de las tres variedades de Lupinus fue mejor que cuando no se le adicionó.
Se pueden observar las diferencias en el crecimiento de las tres variedades de Lupinus evaluadas en el medio de cultivo Gamborg con (izquierda) y sin (derecha) de Fe-EDTA (Figura 7).
Los resultados obtenidos se deben a que el medio de cultivo MS tiene alta concentración de minerales, es un medio rico y salino que puede ser perjudicial para ciertas especies de plantas, para evitar esto, es utilizado a menudo con la concentración de los microelementos completos y los macroelementos a la mitad o tres cuartos de la concentración descrita originalmente (Murashige y Skoog, 1962). Los contenidos y la fuente de amonio difieren en los dos medios de cultivo empleados, los iones de amonio disminuyen el crecimiento celular cuando las concentraciones exceden de 2 mM. Esta reducción en el índice de crecimiento se debe a la inhibición de algunas enzimas del ciclo de Krebs (Gamborg, 1970).
Estos resultados difieren de los logrados por Karaguzel et al. (2004) en L. varius L., donde obtuvieron plántulas con una altura de 5.81 cm y longitud de raíces de 7.5 cm a los 12 días de cultivo en un invernadero de plástico con tratamientos de 14 y 16 horas y con el uso de iluminación fotoperiódica. Los resultados alcanzados indican que L. varius L., se comporta como una planta facultativa de día largo. En L. montanus se alcanzaron alturas de plántulas de 11.5 cm cuando en el medio de cultivo adicionaron una auxina y una citoquinina (Ramírez-González et al., 2015).
Esto puede ser debido al efecto del estrés oxidativo generado por una acumulación de Fe en exceso en el medio de cultivo o la liberación de formaldehído en el medio de cultivo por la fotodegradación del Fe-EDTA (Molassiotis et al., 2003). En mutantes de chícharo (Pisum sativum L.) con defectos en la regulación de la absorción del hierro, se observó que el Fe se acumula en las ferritinas y estas precipitan dicho metal para depositarlo en forma de partículas denso-electrónicas en el citoplasma, mitocondrias y retículo endoplasmático y que esto constituye un mecanismo de defensa de la planta contra la acumulación excesiva de Fe soluble el cual da lugar a estrés oxidativo (Becker et al., 1988; Lazarowski et al., 2022).
Los medios de cultivo contienen diferente composición salina, el estrés osmótico provocado por un medio rico en sales podría hacer que el metabolismo de los tejidos vegetales estimule la liberación de compuestos que son fáciles de oxidar y dan lugar a fitotóxicos (Turkan y Demiral, 2009). El Fe es esencial para el crecimiento celular y se le debe agregar al medio de cultivo en una concentración de 0.01 a 0.15 mM bajo la forma de quelato Fe-EDTA; ya que, esta forma aumenta la solubilidad del hierro (Llorente, 2000).
El Fe puede participar en reacciones donde se liberan radicales libres y otras especies de oxígeno reactivas que son tóxicas. Este estrés oxidativo puede llevar a la disfunción de actividades metabólicas y daño en el ADN (Molassiotis et al., 2003). La respuesta al estrés por Fe varía entre las especies de Lupinus, ya que la formación de raíces en racimos en condiciones de estrés con Fe depende de los mecanismos de absorción de los iones y la correlación de la actividad de la ATPasa de la raíz y el transporte de iones a través de la membrana plasmática.
La investigación de Marschner (1995) refiere que en términos de la gran capacidad de las raíces excreta protones y reduce el Fe(III), y se asemejan a las zonas de raíces apicales que contienen células de transferencia. Ciertamente, las especies de Lupinus como L. albus L., L. cosentinii Guss. y L. pilosus L., que producen raíces en racimo, son mucho menos sensibles a la deficiencia de hierro en comparación con las especies de Lupinus que no producen raíces en racimo, como L. angustifolius y L. luteus (Tang y Robson, 1993; Tang et al., 1995; Planchuelo, 2022). En las raíces en racimo de L. albus que se desarrollan bajo estrés por hierro, las raicillas individuales no se hinchan y alcanzan menos ancho que las que se desarrollan bajo estrés por fosfato.
La escarificación química promovió la germinación in vitro de las especies silvestres de Lupinus evaluadas. El mayor porcentaje de germinación para L. campestris fue de 83, L. exaltatus de 63 y L. montanus de 12, respectivamente y se obtuvo cuando las semillas estuvieron en inmersión en ácido sulfúrico durante 30 min. El medio de cultivo influyó en la germinación de las especies en estudio. En L. exaltatus se encontró el mayor porcentaje de germinación en el medio de cultivo Gamborg con Fe-EDTA y sin Fe-EDTA donde se registró mejor respuesta en L. exaltatus.
Las variables de crecimiento longitud de raíces, longitud de tallo y número de hojas los mejores resultados se alcanzaron en el medio de cultivo Gamborg con Fe-EDTA cuando se comparó con los resultados logrados en el medio de cultivo MS. Por lo tanto, se concluyó que la escarificación química y el tiempo de inmersión influyen en la germinación de las semillas, pero depende de la especie. El medio de cultivo contribuye en la germinación sin la adición de Fe-EDTA.
Al Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCYT): proyecto CB-2012-01-181428) y a la Línea Prioritaria de Investigación Conservación y Mejoramiento de Recursos Genéticos del Colegio de Postgraduados por el apoyo económico para la realización del presente estudio.
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