elocation-id: e3382
Las bacterias patógenas son responsables de grandes afectaciones en los principales cultivos, causan desde daños moderados hasta pérdida total. En plantas de ajo cultivadas durante el ciclo otoño-invierno 2016-2017 en dos localidades, Celaya e Irapuato (estado de Guanajuato, México), se detectaron síntomas de estrías amarillas en el margen de la hoja desde los dos meses después de la siembra. El objetivo de este trabajo fue aislar e identificar los agentes causales asociados a estos síntomas. A partir de 62 muestras de follaje con manifestaciones características de la enfermedad en tres materiales de ajo, se obtuvieron 74 aislados bacterianos puros y se seleccionaron los 13 más representativos, según su morfología colonial, que fueron identificados molecularmente por amplificación y secuenciación del gen ribosomal 16S. Para la localidad de Celaya se identificaron las especies Pantoea agglomerans, Bacillus amyloliquefaciens, Erwinia persicina, Bacillus megaterium y Bacillus mojavensis y para Irapuato Bacillus aryabbattai, B. amyloliquefaciens, B. megaterium, Erwinia persicina. Estas bacterias resultaron ser de importancia fitosanitaria en la fase de desarrollo vegetativo y formación de bulbo, pues se lograron recuperar a partir de tejido dañado obtenido de plantas previamente inoculadas. Hasta donde se sabe, este es el primer reporte de la presencia de dichas bacterias relacionadas con los síntomas descritos en cultivos de ajo y con el deterioro de los bulbos durante su almacenamiento poscosecha.
Allium sativum L, bacteriosis en ajo, identificación molecular, patogenicidad.
Actualmente, aproximadamente el 90% de las plantas cultivadas a nivel mundial son propagadas por medio de semillas, las semillas se consideran la fuente más importante para la propagación de patógenos, lo que favorece infecciones primarias tempranas (Navarrete-Maya et al., 2014).
La presencia de bacterias fitopatógenas en los cultivos y sus enfermedades asociadas reducen significativamente el rendimiento, con un gran impacto económico. Las infecciones causadas por virus, bacterias, hongos y otros patógenos alteran los procesos fisiológicos de la planta incluyendo la absorción de agua y de nutrientes minerales por el sistema radical. Esto provocó las necrosis radicales causadas por oomicetos Phytophthora spp., algunas especies de Fusarium y los nemátodos Pratylenchus spp., la translocación del agua en el xilema y nutrientes absorbidos por raíces sanas; distorsiona la actividad meristemática por el desarrollo de chancros en troncos y ramas, promueve tumores y nodulaciones radicales (por ejemplo, antracnosis, manchas necróticas, mildius, oídios y royas) que distorsionan la absorción de radiación reduciendo la eficiencia fotosintética y la redistribución de los asimilados (ej., carbones, fitoplasmosis, mildius, oídios, royas y virus) (Jiménez, 2017).
En la mayoría de los reportes no se hace referencia a las enfermedades causadas por bacterias, debido a que anteriormente no era común encontrarlas afectando los cultivos hortofrutícolas. No obstante, el cambio climático, representado por alteraciones en la humedad del suelo, lluvia, ha desencadenado un aumento en las poblaciones de insectos que son vectores de virus y bacterias, además de incrementar la capacidad patogénica de microorganismos que no estaban reportados (Hawkes et al., 2017).
El ajo es una de las hortalizas con mayor producción mundial (FAO, 2018), su reproducción se da por selección de los bulbos con buena sanidad en campo y se utiliza un sistema de propagación vegetativa que ha causado la acumulación de virus, bacterias, nematodos y hongos en las plantas (O’Neill et al., 2018).
La interacción planta-patógeno es además influenciada por componentes ambientales, incluyendo elementos abióticos del suelo, agua y aire, la microbiota del suelo, de las superficies y tejidos vegetales, así como los insectos que contribuyen a la dispersión y transmisión de los patógenos (Jiménez, 2017).
El ajo es susceptible al ataque de patógenos que cau san enfermedades tanto en el follaje como en los bulbos. Las enfermedades más frecuentes en ajo son: mancha púrpura (Alternaria porri Ellis), podredumbre blanca (Stromatinia cepivora Berk.), mildiu (Peronospora destructor Berk.), moho gris (Botrytis spp.), tizón sureño (Sclerotium rolfsii), roya (Puccinia alli P.), virosis y una podredumbre blanda (bacteriosis), muy común en otros vegetales, distribuida en regiones cálidas y templadas donde se cultiva ajo y cebolla (Navarro-León et al., 2019).
A la fecha no existe en México semilla comercial certificada de ajo, los productores la seleccionan a partir de su cosecha cada ciclo de producción, con un alto riesgo de reciclar microorganismos patógenos no visibles, que se transmiten por el bulbillo-semilla. El objetivo de esta investigación fue identificar bacterias patógenas asociadas a las estrías formadas en uno o en ambos bordes de la hoja y a la necrosis en punta en plantas de ajo du rante la fase de desarrollo vegetativo, aplicando métodos morfológicos y moleculares.
Se evaluaron tres materiales de ajo de la variedad Taiwán: LPM, Tacátzcuaro Sta. Anita e Incrementos ICA.
La siembra del material biológico se realizó en dos localidades: el campo experimental del Tecnológico Nacional de México, Campus Roque en Celaya, Guanajuato, México (ITR), el 29 de septiembre de 2016 y en el Campo Agrícola Experimental de la División de Ciencias de la Vida del Campus Irapuato-Salamanca de la Universidad de Guanajuato en Irapuato, Guanajua, México (DICIVA-CIS-UG), el 26 de septiembre de 2016.
El ITR está ubicado a 20° 31’ 44” de latitud norte y 100° 48’ 54” de longitud oeste, altitud de 1 767 m y suelos de tipo arcillo-limoso y arcillo-arenoso, de alta permeabilidad, su clima oscila entre semiseco y semicálido, con una precipitación pluvial promedio de 575.3 mm anuales (Inafed, 2017a). La DICIVA-CIS-UG está ubicada en longitud 101° 34’ 09” longitud oeste, latitud 20° 51’ 18” latitud norte, altitud 1 730 m con tipo de suelo de tipo arcilloso, su clima es semicálido subhúmedo, con una precipitación de 800 mm anuales (Inafed, 2017b).
La toma de muestras para la detección de bacterias se realizó por muestreo de follaje de ajo a los 135 días después de la siembra (dds) en las localidades de Irapuato (31 muestras) y de Celaya (31 muestras), para un total de 62. Se obtuvo una muestra de una hoja en 10 plantas representativas para cada síntoma presuntivo de bacteriosis: 1) necrosis en punta de follaje, 2) rayado unilateral, R1 y 3) rayado en ambos lados de la hoja, R2, así como la muestra de una planta aparentemente sana (Testigo). Una vez registradas, se colocaron en bolsas de polietileno y se mantuvieron en refrigeración (4 (C) hasta su procesamiento.
El procesamiento de muestras y diagnóstico e identificación de los agentes etiológicos de la enfermedad se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular del ITR, Celaya, Guanajuato, México.
Cada muestra de follaje se lavó y se colocó sobre papel filtro estéril. Para las muestras que presentaban daño visible, se obtuvieron muestras con 50% de tejido sano y 50% enfermo de 0.5 a 1 cm, para los testigos, se tomaron muestras de diferentes partes de la hoja. A continuación, todas las muestras se trataron con hipoclorito de sodio al 1% durante 30 s, 1 min en agua destilada estéril, 1 min en etanol al 70% y 1 min en agua destilada estéril, se colocaron en caja Petri con agar papa dextrosa (PDA, difco) y se incubaron a 28 ±2 °C durante 24-48 h. Posteriormente se realizó el aislamiento en medio de cultivo para obtener cada una de las cepas puras, de donde se describió la morfología colonial de las bacterias identificadas en Celaya e Irapuato, respectivamente. En muestras los testigos no presentaron desarrollo de patógenos a las 72 h de incubación.
A partir de las cepas puras de las bacterias aisladas se procedió a realizar la extracción directa del DNA (Wizard Genomic DNA Purification Kit, PromegaMR, Cat. A1120), conforme al protocolo del fabricante. La concentración e integridad del DNA se verificó por espectrofotometría UV a 260 nm en un espectrofotómetro nanodrop 2000c (Thermo ScientificMR) y electroforesis en gel de agarosa al 0.8%.
Los iniciadores de la reacción de PCR fueron 16S (5’ AGAGTTTGATCMTGGC 3’) y A20 (5’ CCGTCAATTCMTTTGAGTTT 3’) para la amplificación de un fragmento del gen 16S rDNA (Klindworth et al., 2013). La reacción se llevó a cabo en un termociclador (SimpliAmp Thermal Cycler marca Life TechnologiesMR), con temperatura de alineamiento de 56 °C. Los productos de amplificación por PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 0.8% y fueron fotodocumentados en un Gel DocMR EZ Imager marca BIO-RAD.
La secuenciación de los fragmentos amplificados se llevó a cabo en el Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad (Langebio-CINVESTAV-IPN Irapuato), con el equipo Applied BiosystemsMR Modelo 3730, mediante el método Taq FS Dye terminator cycle sequencing fluorescence-based, con la técnica de Sanger y tecnología capilar.
Los electroferogramas y secuencias obtenidas se analizaron con el programa FinchTV v 1.4.0 (Geospiza Inc.), se realizó la edición eliminando las regiones extremas con ambigüedades en secuencia y se compararon las secuencias obtenidas en ambos sentidos de las cadenas complementarias; posteriormente, con la herramienta Blast (the basic local alignment search tool: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) se realizó el alineamien to con la base de datos del GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Una vez confirmadas, se publicaron las secuencias para registrarlas como aislados obtenidos en la presente investigación (Cuadro 1) en la base de datos del NCBI.
Para efectuar las pruebas de patogenicidad se utilizó el material LPM seleccionando bulbos con apariencia sana que se establecieron en condiciones de invernadero (temperatura de 12 a 14 °C) (Khade et al., 2017), se permitió su germinación y desarrollo hasta la etapa de cuatro hojas, se verificó que mantuvieran un estado saludable hasta antes de la inoculación con cepas puras de los aislados.
Como inóculo, se utilizaron suspensiones de 10 000 ufc ml-1 correspondientes a dichos aislados. De cada suspensión bacteriana, se inocularon 100 μL, correspondientes a 1 000 ufc, aplicados con jeringa desechable a 2 cm por encima del cuello. Las cepas inoculadas se identificaron como 1, 2, 3, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, se incluyó además un testigo al que se inoculó agua destilada estéril. El experimento se estableció en un diseño completamente al azar, con tres repeticiones.
A partir de los diferentes síntomas (punta, R1 y R2) se obtuvieron un total de 45 cepas puras con morfología variable de la localidad de Celaya, y de éstas se seleccionaron siete cepas representativas para su identificación molecular. De igual forma, se aislaron 29 cepas puras con morfología diferente de la localidad Irapuato, y se seleccionaron seis cepas representativas para la identificación molecular (Cuadro 2 y 3).
En el follaje aparentemente sano (asintomático) no se presentó crecimiento de cepas bacterianas luego 72 h de incubación. Como resultado de la identificación molecular, a cada secuencia ribosomal (16S) obtenida verificada se asignó un número de accesión en la base de datos del NCBI y quedó registrada para acceso libre (Cuadro 1).
A partir de las pruebas de patogenicidad efectuadas, se concluye que las cepas aisladas correlacionan con los síntomas identificados en las plantas sintomáticas, ya que el reaislamiento de las bacterias de tejido afectado permitió la recuperación del mismo microorganismo inoculado, con un valor de chi cuadrada de 1.33 (valor crítico= 3.05, p≤ 0.01). Las plantas muestreadas llegaron a la madurez y los bulbos recuperados de plantas inoculadas mostraron daño evidente y menor peso en relación al testigo.
En el ciclo otoño-invierno (O-I) 2015-2016 se observaron los primeros síntomas de enfermedad bacteriana en la localidad de Irapuato. Al no existir a nivel nacional registro de los daños causados en el ajo por los patógenos identificados, los resultados obtenidos en esta investigación evidencian, por primera vez, la causalidad de estas bacterias en la afectación del cultivo de ajo en México.
Para favorecer la brotación de la plántula de ajo sin efectos negativos sobre los rendimientos comerciales, se ha establecido una temperatura de 14 a 17 °C combinada con humedad relativa de 60% (Burba, 2009). En temperatura superiores, las catáfilas que cubren los bulbillos de ajo, cambian su color de moteado a rosado transparente en fresco y se presenta una necrosis, que oscurece el tejido y se desintegran casi por completo cuando la invasión es muy severa principalmente del género Bacillus y algunas fitopatógenas (Philip, 2017).
Debido a su alto contenido y disponibilidad de agua, la mayoría de las frutas y hortalizas despliegan valores de actividad de agua (Aw) superiores a 0.85 (Badui, 2012), que favorecen el rápido crecimiento de diversos microorganismos y la activación de distintas funciones metabólicas. Cuando no se tiene un buen control del agente causal durante el desarrollo del cultivo de ajo, se presenta una pudrición blanda generalizada en el bulbo de ajo, denominada ‘putrefacción bacteriana’. Este proceso ha sido documentado previamente y se relaciona con el ataque de bacterias como agente causal de la enfermedad (Navarrete-Maya et al., 2014).
Con respecto a las bacterias patógenas identificadas durante esta investigación, en las dos localidades de estudio, las especies bacterianas más frecuentes fueron: Bacillus amyloliquefaciens (76.7%), B. megaterium (37.24%) y B. aryabhattai (24.14%), Erwinia persicina (55.25%), Pantoea agglomerans (4.44%) (Cuadros 2 y 3). Se ha documentado que las bacterias son microorganismos especialmente frecuentes en hortalizas y verduras que crecen en contacto directo con el suelo, principalmente del género Bacillus y algunas fitopatógenas (Philip, 2017).
Las especies del género Erwinia y Pantoea se limitan a vivir sobre las superficies vegetales o a ejercer un papel secundario en diversas infecciones, además de las especies patógenas que producen pudriciones blandas, donde se destacan E. carotovora y E. chrysanthemi (ahora Pectobacterium carotovora subsp. carotovora y P. chrysanthemi), cuya importancia se incrementa por el amplio rango de hospedantes y su distribución mundial, así como por sus mecanismos de sobrevivencia y dispersión. (Navarrete-Maya et al., 2014).
En bulbos se han aislado Pectobacterium carotovorum, Burkholderia cepacia y Pantoea ananatis (Navarrete-Maya et al., 2014), lo cual coincide con el género Pantoea de una bacteria aislada de síntomas de rayado de un lado y de dos lados en follaje de ajo cultivado en la localidad de Celaya, Guanajuato.
El desarrollo de varias especies de bacterias fitopatógenas del género Erwinia produce podredumbre húmeda bacteriana, ya que al sintetizar enzimas que actúan sobre la pectina existente en la lámina media de los tejidos de estos productos (Palacio-Bielsa et al., 2012). Algunas de las cepas aisladas durante la presente investigación pertenecen al género Erwinia y se asocian a síntomas de punta y de rayado de uno o de ambos lados, es el caso de E. persicina como agente causal de la podredumbre blanda del follaje tanto en Celaya como en Irapuato.
En España se ha incrementado el registro de nuevas bacterias que afectan a los principales cultivos leñosos y hortícolas y es debido a la introducción de material vegetal infectado, se ha reportado Erwinia amylovora con graves pérdidas económicas en numerosos países mediterráneos (Palacio-Bielsa et al., 2012). Esta bacteriosis también podría considerarse una amenaza para la agricultura en México. La presencia de Erwinia persicina en el cultivo de ajo en las localidades de Irapuato y Celaya correlacionan con esta aseveración. En muestras de follaje de ajo obtenidas en Celaya, se aislaron tanto cepas individuales como consorcios de dos cepas, en las muestras colectadas de follaje tales como: Bacillus amyloliquefaciens + B. megaterium 8.88% de las muestras con síntomas en punta y R1; B. amyloliquefaciens + Erwinia persicina 8.88% en síntomas de punta, R1 y R2; E. persicina + B. megaterium con 6.66% en síntomas de punta y R1; B. amyloliquefaciens + Pantoea agglomerans 2.22% en rayado de un lado (R1) y Pantoea agglomerans + E. persicina con 2.22%, en rayado de dos lados (R2).
La calidad de bulbos de ajo de Celaya fue aceptable debido a que se controló el problema mediante la aplicación de bactericidas químicos durante el desarrollo del cultivo (sulfato de gentamicina y clorhidrato de oxitetraciclina; kasugamisina y tetraciclina), mientras que en Irapuato se consideró pérdida total de la cosecha debido a manejo inadecuado y a la presencia de re-inóculo en suelo debido a la asignación del mismo lote de cultivo que el año anterior. Esto podría relacionarse con el caso de un patógeno reportado en el sureste de España; al determinar la posible transmisión de bacterias a través de semillas, se confirmó la presencia de Erwinia aphidicola en semillas de frijol, causando una disminución de más del 50% en la producción y además, se identificaron Bacillus simplex/Bacillus muralis, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas putida y Paenibacillus polymyxa (Marín et al., 2011).
En 2013, algunos investigadores reportaron la presencia de Erwinia persicina, en Europa, asociada a síntomas de podredumbre blanda rosada en bulbos de ajo de tipo chino recolectados de Tembleque (Toledo, España), el 50% de los bulbos mostraban estos síntomas en al menos un diente y el color rosado a lo largo del bulbo. Mediante pruebas moleculares se identificó E. persicina como agente causal, siendo este el primer reporte en cultivo de ajo en Europa (Gálvez et al., 2015).
Estos resultados coinciden con los encontrados en Celaya e Irapuato, ya que se aisló Erwinia persicina en síntomas de punta y rayado de uno y dos lados en follaje de ajo, al igual que coinciden los síntomas en bulbos durante el almacenamiento y al momento de seleccionar la semilla para la siembra. Casos similares, los aislados de Celaya e Irapuato que se identificaron como E. persicina provocaron síntomas de punta, R1 y R2 en follaje de ajo.
B. amyloliquefaciens se ha considerado un agente de control biológico y fuente de antibióticos y otros metabolitos secundarios para el biocontrol de patógenos de plantas, puede inhibir el crecimiento de hongos patógenos como: Fusarium oxysporum, Candida albicans y Penicillium citrium (Li et al., 2016). Esta especie fue aislada como cepa única, en el follaje de algunas plantas de ajo de Irapuato, con síntomas en punta, R1 y R2 y también se aisló en Celaya, pero en combinación con otras cepas, por lo que no parece ser de lo más recomendable como agente de biocontrol en cultivos de ajo; sin embargo, es necesario seguir realizando pruebas para determinar su comportamiento tanto in vitro como en campo.
B. megaterium, es una especie con capacidad fitopatológica que ha sido aislada a partir de semillas, suelo y agua. Su presencia en follaje de ajo se asoció con síntomas de punta, R1 y R2 en la localidad de Celaya, así como con síntomas de punta y R1 en Irapuato. Recientemente se descubrió que la cepa A12 (BMA12) B. megaterium estimula el crecimiento de las plantas de tomate en condiciones salinas (Akram et al., 2019).
A pesar de que algunas cepas de Bacillus aryabhattai contribuyen en la solubilización de zinc y que pueden utilizarse como bioinoculantes para biofertilización y biofortificación (Aketi et al., 2014), los resultados en esta investigación fueron diferentes, ya que Bacillus aryabhattai se aisló de forma individual en la localidad de Irapuato y su presencia se asoció a daños severos en ajo tanto en follaje como en los bulbos.
El género Pantoea incluye varias especies generalmente asociadas a plantas, ya sea como epífitas o fitopatógenas. La especie Pantoea Agglomerans, fue solamente aislada en muestras de Celaya. Se caracteriza por la formación de otro tipo de estructura multicelular llamada symplasmata y mantiene la capacidad de formar biopelículas (Yang et al., 2017). Durante el desarrollo de esta investigación, P. agglomerans se aisló de follaje en cultivos de ajo con síntomas R1 y R2 asociado con E. persicina y B. amyloliquefaciens, por lo que se identifica como patógeno y agente causal de bacteriosis.
B. mojavensis es endófito con propiedades antibacterianas de amplio espectro (Jasim, et al., 2016); sin embargo, en Celaya se aisló de manera individual causando daño en follaje y bulbo de ajo.
Se encontraron enfermedades emergentes, al identificar seis bacterias asociadas a las plantas de ajo con síntomas en follaje de estrías en hojas (un borde o ambos) y en punta, se procesaron 15 aislamientos bacterianos, identificando molecularmente seis especies en fase de desarrollo vegetativo del cultivo, se detectó: Bacillus aryabhattai, Pantoea agglomerans, E. persicina, Bacillus amyloliquefaciens, B. megaterium, B. mojavensis, por lo anterior se considera que son agentes fitopatógenos capaces de afectar tanto el follaje como el bulbo de ajo, por lo que representan un riesgo fitosanitario para este cultivo.
Las especies bacterianas identificadas en Irapuato fueron: Bacillus aryabhattai, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus megaterium y Erwinia persicina. Las cepas de las bacterias patógenas aisladas se encontraron en forma única, capaces de disminuir el rendimiento y ocasionar la pérdida total de la cosecha. Las especies bacterianas identificadas en Celaya fueron: Pantoea agglomerans, E. persicina, Bacillus amyloliquefaciens, B. megaterium, B. mojavensis. Se encontraron de forma única el 71.11% y en consorcio de dos cepas un 28.88%.
Pueden actuar de forma única o en consorcio y llegan a producir en follaje y bulbo de ajo pudrición blanda. En comparación con los aislados en Irapuato solamente se encontró solo una colonia en el 100% de las muestras. Cabe la posibilidad de que el B. amyloliquefaciens esté relacionado con la cepa de E. persicina o con otras especies de bacterias; sin embargo, queda como un panorama por explorar. Los patógenos comunes aislados en Irapuato y Celaya fueron Bacillus amyloliquefaciens, Erwinia persicina y Bacillus megaterium. Se encontraron en consorcios de dos cepas. Se confirmó que las bacterias recuperadas en plantas inoculadas con síntomas correspondieron a las cepas inoculadas.
Eliminar los restos vegetales al término del cultivo, voltear los suelos con arado para que la intemperización reduzca las poblaciones de bacterias en el próximo año, hacer rotación de cultivos de diferente familia botánica, controlar insectos y malezas que sean reservorios de bacterias, disminuir la fertilización nitrogenada en caso de presencia de síntomas de bacteriosis, evitar la presencia prolongada de agua libre sobre plantas y suelo; usar riego por goteo, desinfectar herramientas utilizadas en manejo del cultivo, aplicar control químico al bulbo-semilla durante el almacenamiento, en la siembra, de manera preventiva en etapa de plántula, así como durante el desarrollo de todo el cultivo.
Se agradece el apoyo al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca asignada a MJNL Núm. 236955 para la realización de esta investigación. Asimismo, al Tecnológico Nacional de México por el apoyo del proyecto: estudio fitopatológico de la interacción ajo-complejo bacterial Núm. 5426.19P.
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