elocation-id: e3205
En Oaxaca, México, las poblaciones de Agave nussaviorum están disminuyendo y se propone micropropagarlo en complemento al uso de métodos convencionales. El objetivo del trabajo fue evaluar el efecto de la concentración de sales inorgánicas y ácido indol-butírico en el medio de cultivo, así como el ambiente de incubación, para enraizar brotes in vitro. Brotes cultivados in vitro se transfirieron para su enraizado a nueve variantes de medio de cultivo que diferían en concentración de sales inorgánicas del medio de cultivo (60, 80 y 100%) y ácido indol-butírico (0, 0.5 y 1 mg L-1) en un diseño factorial con nueve tratamientos. Durante 28 días, todos los cultivos se incubaron en laboratorio con iluminación led y se evaluó el porcentaje de brotes con raíces. A partir del día 29 la mitad de los cultivos en cada variante de medio de cultivo se separaron para incubarlos durante 21 días expuestos a radiación solar disminuida 40% mediante malla sombra en invernadero, mientras el resto continuó en incubación con lámparas led en laboratorio. Al término del primer periodo, el mayor porcentaje, 83.3% de brotes con raíces, estaban en medio de cultivo con 60% sales inorgánicas y 0.5 mg L-1 de ácido indol-butírico. Al término del segundo periodo todos los brotes tenían raíces adventicias en las condiciones siguientes: medio de cultivo con 60% sales y 0.5 o 1 mg L-1 ácido indol-butírico incubados en laboratorio; medio de cultivo con 60% sales inorgánicas, 1 mg L-1 ácido indol-butírico e incubados en invernadero, medio de cultivo con 100% sales inorgánicas, 0.5 mg L-1 ácido indol-butírico e incubadas en invernadero.
Agave nussaviorum, micropropagación, raíces adventicias.
Las especies Agave angustifolia (Cruz-García et al., 2013), A. tequilana (Arzate-Fernández et al., 2016), A. potatorum (Molina-Guerrero et al., 2007), A. americana var. oaxacensis (Pérez-Santiago et al., 2014; Cruz-García et al., 2017) y A. nussaviorum, son utilizadas para elaborar bebidas destiladas. Durante el año 2021, en Oaxaca se tuvieron 10 839.57 ha de plantaciones y cosecharon 2 992.19 ha (SIAP, 2021). No hay datos publicados sobre la magnitud de colecta de agaves silvestres.
El A. nussaviorum, que en la región Mixteca de Oaxaca se le conoce como papalomé, se utiliza para alimento y en medicina tradicional (García-Mendoza, 2010), pero también para elaborar mezcal. Esta especie se colecta de poblaciones silvestres, por lo que se propone su propagación para establecer plantaciones. El cultivo de tejidos vegetales se aplica en agaves para producir mayor cantidad de plantas en complemento a los procedimientos convencionales de propagación. Y se tienen antecedentes de la micropropagación de Agave tequilana (Valenzuela-Sánchez et al., 2006), A. angustifolia (Ríos-Ramírez et al., 2017), A. fourcroydes (Madrigal et al., 1990), A. americana var. Oaxacensis (Enríquez-Valle et al., 2013) y A. salmiana (Silos-Espino et al., 2007).
La propagación in vitro comprende cinco etapas: a) preparación de las plantas madre en condiciones higiénicas; b) establecimiento de cultivos asépticos; c) multiplicación de propágulos; d) enraizado de brotes y e) trasplante a contenedores con sustrato para su aclimatación en invernadero (George y Debergh, 2008). Para las etapas b, c y d, se requiere determinar las condiciones de sales minerales, carbohidratos, vitaminas, reguladores de crecimiento en el medio de cultivo y el ambiente de incubación (Puente-Garza et al., 2017).
La calidad de la planta micropropagada influye en el éxito de su aclimatación. En relación con la etapa d, la capacidad de los tejidos para formar raíces adventicias depende de factores endógenos (genotipo, condición fisiológica, etc.) y factores exógenos (sustrato, humedad relativa, temperatura, irradiancia). Para que los brotes formen raíces, éstos se establecen en medios de cultivos (MC) sin reguladores de crecimiento (RC) o con un RC de tipo auxina.
Durante el enraizado in vitro de brotes de A. angustifolia (Enríquez-Valle et al., 2005) y A. potatorum (Bautista-Castellanos et al., 2020) mayor cantidad de brotes formaron raíces, más abundantes y en menos tiempo cuando se establecieron en MC con auxinas. En ambas especies los brotes en MC con las sales minerales MS (Murashige y Skoog, 1962) a 75% tuvieron mejor respuesta de enraizado en comparación con brotes en MC con las sales MS a100%. Miguel-Luna et al. (2013) reportaron que brotes de A. americana var. oaxacensis establecidos en MC con sales MS a 66%, formaron 7.3 raíces adventicias en promedio, cantidad 15% superior a las raíces formadas en brotes establecidos en MC con sales inorgánicas al 100%.
La concentración de solutos en el MC, principalmente sales inorgánicas y sacarosa determina el potencial osmótico (Ψ) de éste, que influye en la formación, cantidad y crecimiento de las raíces en los brotes, ya que niveles menores a -0.3 MPa inhiben la formación de raíces (Cárdenas-Lara y Villegas-Monter, 2002).
Las plantas propagadas in vitro presentan hojas con consistencia herbácea, delgadas, con escaso desarrollo de cutículas, raíces ineficientes, alta densidad estomática y estomas con escaso control de la apertura y cierre. Y cuando estas plantas se extraen del cultivo in vitro a un ambiente con menor humedad relativa, presentan dificultades para controlar la pérdida de agua, quedando expuestas a marchitamiento excesivo, además de presentar actividad fotosintética baja (Pospíšilová et al., 2000; Pospíšilová et al., 2007; Sosa- Castillo et al., 2014).
Plantas micropropagadas de A. americana var. Oaxacensis, durante su aclimatación en invernadero sustituyeron varias hojas que habían formado durante su cultivo in vitro, por nuevas hojas con características diferentes relacionadas con su ajuste al ambiente ex vitro (Cruz-García et al., 2017). Los agaves micropropagados deben poseer características morfológicas y fisiológicas que cuando se extraigan grandes cantidades de plantas de los MC tengan menos dificultades para su adaptación al ambiente ex vitro, logrando altos niveles de supervivencia y crecimiento (Miguel-Luna et al., 2013; Enríquez-Valle et al., 2016).
Autores como Pospíšilová et al. (1999) describieron que plantas micropropagadas durante las primeras tres a cuatro semanas de aclimatación detienen su crecimiento e incluso reducen su tamaño debido a la senescencia de órganos. Se argumenta que dichas hojas mueren porque no tienen capacidad de hacer cambios relacionados con su ajuste al ambiente ex vitro. Lo deseable es que la planta cultivada in vitro desarrolle órganos que persistan y sean eficientemente funcionales durante y posterior a la aclimatación. En la micropropagación de Musa, Texeira-da Silva et al. (2005) sometieron cultivos in vitro de Musa y Cymbidium en la etapa de enraizado a un proceso de pre-aclimatación o pre-adaptación, al exponerlos a radiación solar disminuida mediante sombra parcial, condiciones ambientales con menor humedad relativa. El objetivo de la investigación fue evaluar el efecto de la concentración de sales minerales del medio MS y de la auxina AIB en el medio de cultivo, en el enraizado de brotes de A. nussaviorum, así como del ambiente de incubación en las características morfológicas de las plantas.
El trabajo se realizó en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales y en un invernadero, en el Instituto Tecnológico del Valle de Oaxaca, en el Municipio de Santa Cruz Xoxocotlán, Oaxaca. Se obtuvieron cultivos in vitro de racimos de brotes heterogéneos en tamaño, de A. nussaviorum en la etapa de multiplicación de propágulos.
De cada racimo se seleccionaron los brotes con 3 a 4.5 cm de longitud de la hoja mayor, se separaron individualmente y se establecieron en frascos de 160 cm3 que contenían 20 ml de alguna de las nueve variantes de MC esterilizado y con consistencia de gel, preparados con: agua destilada, 1 mg L-1 tiamina-HCL, 25 g L-1 sacarosa, 100 mg L-1 mio-inositol; sales minerales MS (Murashige y Skoog, 1962) en tres diluciones diferentes (60, 80 y 100%), ácido indol-3-butírico (AIB) en tres concentraciones diferentes (0, 0.5 y 1 mg L-1), el pH ajustado a 5.8 antes de agregar 5.7 g L-1 de agar. Se establecieron dos brotes en cada frasco de cultivo, se colocó la tapa y se selló con polietileno adherente.
Los primeros 29 días de la etapa de enraizado todos los cultivos se incubaron en laboratorio, expuestos a iluminación LED, a 35 μmol m-2 s-1, en fotoperiodos de 16 h y 8 h de oscuridad, temperatura en el rango de 15-28 °C. Transcurrido ese tiempo, la mitad de los cultivos de cada variante de MC se transfirieron a ambiente de invernadero, para exponerlos durante los restantes 21 días a iluminación con radiación solar disminuida mediante doble capa de malla sombra 40%, mientras que la otra mitad de los cultivos permanecieron en laboratorio con iluminación LED.
Cuando se establecieron los brotes en el medio de enraizado se tomaron datos de altura y número de hojas y diariamente durante los 50 días de esta etapa se registraba los brotes que tuvieran raíces y la cantidad de raíces adventicias. Al término de esta etapa, las plantas se extrajeron del medio de cultivo y se registró la cantidad de hojas desplegadas, la longitud y anchura de la hoja más grande, diámetro del tallo, número de raíces.
El experimento se estableció de acuerdo a un diseño completamente al azar, que en los primeros 29 días de esta etapa fue con arreglo de tratamientos factorial 3 × 3, tres niveles del factor concentración de sales minerales, tres niveles del factor concentración de AIB, y tuvieron nueve tratamientos para los días 30 a 50 de la etapa de enraizado, el arreglo de tratamientos fue factorial de 3 × 3 × 2, que incluyó los niveles de los factores citados y se agregó el factor ambiente de incubación con dos niveles (laboratorio e invernadero), por lo que se tuvieron 18 tratamientos.
La unidad experimental fue un brote y se tuvieron 12 repeticiones por tratamiento. Para comparar los porcentajes de brotes que formaron raíz, la unidad experimental fue un grupo de cuatro brotes y se tuvieron seis y tres repeticiones por tratamiento, en los días 29 y 50 del experimento, respectivamente. Los datos en porcentaje para su análisis se transformaron a arcoseno. Los datos se sometieron a análisis de varianza y comparación de medias mediante la prueba de Tukey (α≤ 0.05).
Al inicio de la etapa de enraizado, los brotes de los diferentes grupos tenían de 3.4 a 4.5 hojas y 3.6 a 4.4 cm de altura, que en cada caso fueron magnitudes no significativamente diferentes, indicando que el material vegetal que se distribuyó en los diferentes tratamientos fue relativamente homogéneo. Cuando transcurrieron ocho días de establecer los brotes en el medio de cultivo se observaron los primeros brotes con raíces adventicias. De los grupos de brotes que se establecieron en las diferentes variantes de MC, cuando transcurrieron 29 días de incubación en condiciones de laboratorio, entre el 58.33% al 83.33% de los brotes tenían raíces (Figura 1A).
Los brotes en MC con sales minerales (SM) al 80% y con 1 mg L-1 AIB formaron 7.5 raíces adventicias, tres veces la cantidad de raíces que tuvieron los brotes en MC con SM-100%, sin AIB. Los menores porcentajes de brotes con raíces, fueron aquellos en MC con las sales minerales MS-100% y sin AIB. Ordenando las variables en función de los niveles de factores, el porcentaje mayor de brotes con raíces (PBR) fue en MC con sales SM-60%, y 0.5 mg L-1 AIB, mientras que los brotes con mayor número de raíces fueron en MC con sales SM-60%, y 1 mg L-1 de AIB (Figura 1 B).
En algunos brotes se observaron raíces a los ocho días, mientras que en otros brotes se observaron raíces hasta los 50 días. En otras especies A. tequilana (Monja-Mio et al., 2020); A. angustifolia en MC con sales inorgánicas MS-50% y 0.025 mg L-1 de 2,4-D (Sánchez et al., 2020) y A. fourcroydes (Garriga et al., 2010) se reporta que el 100% de brotes formaron raíces. Asimismo, Bautista-Castellanos et al. (2020) reportan que en brotes de Agave potatorum Zuc, las raíces adventicias se observaron entre los 13 y 37 días de incubación.
Los brotes que se establecieron en MC con AIB y sales inorgánicas a 75% de concentración, el 95% de éstos formaron raíces adventicias. Los datos del presente estudio coinciden con los trabajos anteriores de que los brotes tuvieron mejor respuesta de formación de raíces adventicias cuando se establecieron en MC con concentraciones bajas (60 u 80%) de sales minerales.
Transcurridos los 50 días de incubación en la etapa de enraizado, los análisis de varianza (Cuadro 1) mostraron que las concentraciones de sales minerales tuvieron efectos significativos (p≤ 0.03) en el número de hojas; los niveles del factor concentración de ácido Indol-3-butírico (AIB), tuvieron efectos significativos en el número de raíces (p≤ 0.01) y en la longitud de la raíz (p≤ 0.03), mientras que los niveles del factor condición de incubación (CI) tuvieron efectos significativos en altura de las plantas (p≤ 0.0002).
[i] FV= fuentes de variación; GL= grados de libertad; CV= coeficiente de variación; AIB= ácido Indolbutírico; CI= condición de incubación; PBR= porcentaje de brotes con raíz (datos transformado arcoseno); NHF= número hoja final; NRF= número de raíces final; LR= longitud de la raíz; ALTF=altura final; DT= diámetro del tallo; ns= no significativo; *= significativo (p> 0.05); **= altamente significativo (p≤ 0.01).
La interacción sales minerales-AIB-condiciones de incubación tuvo efecto significativo (p≤ 0.01) en el número de hojas. Aguilar-Jiménez y Rodríguez de la O (2018) reportaron que brotes A. marmorata cultivados en MC MS al 100%, y con 0.3 o 10 mg L-1 de AIA, formaron en promedio 4.1 y 4.9 raíces adventicias. Mientras que brotes en MC con 3 o 10 mg L-1 de AIA formaron raíces con 8.2 y 9.3 cm de longitud, respectivamente, resaltando la importancia del tipo y concentración de auxina.
Las auxinas inducen la formación y desarrollo de raíces en los brotes y tanto la cantidad y el tipo de auxina, así como la respuesta del explante depende de la especie a trabajar (George et al., 2008). El uso de AIB en medios de cultivo ha demostrado ser eficiente para inducir el enraizado de brotes de A. potatorum (Bautista-Castellanos et al., 2020), A. angustifolia (Enríquez-Valle et al., 2005) y Agave americana (Miguel-Luna et al., 2013).
Al final de la etapa de enraizado de brotes, las plantas tenían de 3.7 a 5.8 hojas, de 2.7 a 7.9 raíces, de 1.2 a 4.9 mm en la longitud de raíces, de 5.6 a 7.9 cm de altura y de 4.7 a 5.8 mm de diámetro de tallo (Cuadro 2). Todos los brotes incubados en laboratorio, en medios de cultivos con sales MS-60% con 0.5 o 1 mg L-1 AIB, tenían raíces.
[i] SI= concentración de sales inorgánicas; AIB= ácido indol-butírico; CI= condición de incubación; BR= brotes con raíz (%); L= laboratorio; In= invernadero; NHF= número de hojas final; NRF= número de raíz final; ALTF= altura final; LR= longitud de la raíz; DT= diámetro de tallo; en cada columna, medias con la misma letra no son significativamente diferentes (Tukey, 0.05). Se presentan los promedios ± error estándar.
Todos los brotes incubados en invernadero, que estuvieron en MC con sales MS-60% y 1 mg L-1 AIB o en MC con sales MS-100% y 0.5 mg L-1 de AIB, formaron raíces adventicias. Enríquez-Valle et al. (2016) reportan que 93.6% de brotes de A. potatorum establecidos en MC con 50% sales minerales MS y 1 mg L-1 AIB e incubados bajo iluminación fluorescente en laboratorio y radiación solar en invernadero, habían formado raíces a los 28 días de incubación.
Durante la incubación la calidad de luz proporcionada por iluminación artificial influye en las características fisiológicas y morfológicas. En el presente trabajo, la intensidad de luz proporcionada por las lámparas LED fue de 35 µmol m-2 s-1, sin variación; mientras que los cultivos incubados expuestas a radiación solar disminuida por malla sombra, durante la segunda mitad del periodo de enraizado, la irradiancia fue muy variable que a medio día estuvo en 400 µmol m-2 s-1, intensidad de luz muy superior y con un espectro de longitudes de onda más amplio, comparada a la iluminación artificial proporcionada en laboratorio.
Las plantas in vitro en la etapa de pre-aclimatación, e incubadas en invernadero, cuando transcurrió una semana en esta condición, sus hojas cambiaron de coloración en el envés, pasaron de un tono verde homogéneo a zonas con coloración rojiza que fue tornando a púrpura transcurridas las tres semanas de pre-aclimatación, así mismo las láminas foliares estaban desplegadas, ligeramente cóncavas hacia el haz y presentaban espinas en los bordes, además de tener una apariencia más rígida.
En cambio, las plantas que permanecieron en laboratorio conservaron sus hojas con coloración verde más homogénea y éstas fueron más grandes con pocas espinas en el borde de la lámina foliar. De acuerdo a Peng et al. (2008) la coloración rojiza y purpura es debido a la presencia de antocianinas que son metabolitos secundarios que protege a las hojas y al aparato fotosintético de daños provocados por la intensidad de luz alta.
Las características de las plantas debido al ambiente in vitro en que se obtienen podría tener consecuencias en la etapa posterior de aclimatación y repercutir en su adaptación en ambiente ex vitro. Teixeira-da Silva et al. (2005) describen que durante el enraizado de brotes in vitro de Musa, se sometieron a condiciones de pre-aclimatación y las plantas así obtenidas desarrollaron mayor vigor, pigmentación, actividad fotosintética, desarrollo de cutícula cerosa.
Las plantas con estas características, cuando se extraen del cultivo in vitro y establecen en contenedores con sustrato y ambiente ex vitro, se adaptan mejor que las plantas de cultivos in vitro incubados todo el tiempo en laboratorio con iluminación artificial. Souza et al. (2021) describen que en la micropropagación de Cattleya warneri T. Moore, los cultivos in vitro incubados en laboratorio tuvieron hojas que fueron 30% menos gruesas, comparadas con las plantas de cultivos incubados en invernadero.
En cultivos in vitro de Vitis vinifera L. (Li et al., 2017) que fueron expuestos a iluminación de diferentes longitudes de onda: blanca, azul, verde y roja, se demostró que las plantas expresan diferentes grupos de genes, que afectan sus desempeños fisiológicos y morfología. La investigación de Borges et al. (2011) reportaron que plantas micropropagadas de Dendranthema grandiflora Tzevele cv. Rage a partir de cultivos in vitro expuestos a radiación solar en la etapa de pre-aclimatación, presentaron hojas más gruesas, mayor área foliar, alta densidad estomática y raíces más desarrolladas y mejoraron su capacidad fotosintética.
En el presente trabajo, las plantas de Agave nussaviorum que se obtuvieron en medios de cultivo en que se redujo la concentración de sales minerales e incorporó AIB y se incubaron exponiéndolos a radiación solar durante parte del tiempo de enraizado, tuvieron características morfológicas apropiadas que aseguran mayor supervivencia durante la aclimatación ex vitro. Además, se disminuyó la cantidad de sales inorgánicas en el medio de cultivo e incubar con radiación solar es una alternativa para disminuir costos de micropropagación.
Todos los brotes de agave que para su enraizado in vitro se establecieron en medios de cultivo con sales inorgánicas a 60%, formaron raíces adventicias, comparados con brotes en medios de cultivo con 80 y 100% de concentración de sales inorgánicas. Los brotes establecidos en medio de cultivo con la auxina AIB formaron mayor cantidad de raíces adventicias que los brotes en medio de cultivo sin auxina. La mejor condición para enraizar brotes de A. nussaviorum fue en medio de cultivo con 60% sales inorgánicas MS y 0.5 o 1 mg L-1 de AIB.
Los brotes incubados en laboratorio desarrollaron mayor altura que los brotes incubados en invernadero, pero éstas últimas desarrollaron hojas más gruesas y rígidas, pigmentación purpura en el envés, características morfológicas que facilitarían su adaptación en ambiente ex vitro. Por tanto, el proceso de pre-aclimatación en invernadero es recomendable puesto que mejora la calidad de las plantas in vitro.
Bautista-Castellanos, A. I.; Enríquez-Valle, J. R.; Velasco-Velasco, V. A. and Rodríguez-Ortiz, G. 2020. Enraizado de brotes in vitro y aclimatación de plantas de Agave potatorum Zucc. Ecosistemas y Recursos Agropecuarios. 7(3):1-13. Doi: https://doi.org/10.19136/era.a7n3.2618.
Borges, D. I.; Oliveira, M. C.; Dos Santos-Penoni, E.; Pereira-De Padua T. R.; Tavares-Braga, F. and Pasqual, M. 2011. Micropropagation of chrysanthemum (Dendranthema grandiflora Tzevele cv. rage) under natural and artificial light in different concentration of the culture media. Plant Cell Cult Microprop. 7(1):1-8.
Enríquez-Valle, J. R.; Estrada-Silias, A.; Rodríguez-Ortiz, G.; Velasco-Velasco, V. A. y Campos-Ángeles, G. V. 2013. Sustrato y dosis de fertirriego en la aclimatización de vitroplantas de Agave americana var. Oaxacensis. Revista de la Facultad de Ciencias Agrarias Uncuyo. 45(2):341-348. Doi: 10.4067/S0718-16202016000200009.
Li, C. X.; Xu, Z. G.; Dong, R. Q.; Chang, S. X.; Wang, L. Z.; Khalil-Rehman, M. and Tao, J. M. 2017. An RNA-Seq analysis of grape plantlets grown in vitro reveals different responses to blue, green, red led light and white, fluorescent light. Frontiers in Plant Science. 8(78):1-16. Doi: https://doi.org/10.3389/fpls.2017.00078.
Monja-Mio, K. M.; Olvera-Casanova, D.; Herrera-Herrera, G.; Herrera-Alamillo, M. A.; Sánchez-Teyer, F. L. and Robert, M. L. 2020. Improving of rooting and ex vitro acclimatization phase of Agave tequilana by temporary immersion system (BioMINT™). In vitro Cellular & Developmental Biology Plant. 56:662-669. https://doi.org/10.1007/s11627-020-10109-5.
Peng, M.; Hudson, D.; Schofield, A.; Tsao, R.; Yang, R.; Gu, H.; Bi, Y. and Rothstein, S. J. 2008. Adaptation of Arabidopsis to nitrogen limitation involves induction of anthocyanin synthesis which is controlled by the NLA gene. Journal of Experimental Botany. 59(11):2933-2944. Doi: 10.1093/jxb/ern148.
Pospíšilová, J.; Haisel, D.; Synková, H.; Čatský, J.; Wilhelmová, N.; Plzáková, Š.; Procházková, D. and Šrámek, F. 2000. Photosynthetic pigments and gas exchange during ex vitro acclimation of tobacco plants as affected by CO2 supply and abscisic acid. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 61:125-133.
Puente-Garza, C. A.; Meza-Miranda, C.; Ochoa-Martínez, D. and García-Lara, S. 2017. Effect of in vitro drought stress on phenolic acids, flavonols, saponins, and antioxidant activity in Agave salmiana. Plant Physiology and Biochemistry. 115:400-407. Doi: https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2017.04.012.
Silos-Espino, G.; González-Cortés, N.; Carrillo-López, A.; Guevara-Lara, F.; Valverde-González, M. E. and Paredes-López, O. 2007. Chemical composition and in vitro propagation of Agave salmiana “Gentry”. Journal of Horticultural Science & Biotechnol. 82(3):355-359. Doi: http://dx.doi.org/10.1080/14620316.2007.11512242.
SIAP. 2021. Sistema de Información Agroalimentaria y Pesquera. Anuario Estadístico de la Producción Agrícola 2013 en México. Sistema de Información Agroalimentaria y Pesquera de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación. México.https://www.gob.mx/siap
Souza, F. L.; Leal, G. A.; Silva, C. V.; Moura-Assis, F. A. M.; Walter, R.; Massi, F. T.; Rangel-Silva, J.; Amaral, G. G.; Pereira, R. W.; Vendrame, W. A. and Campostrini, E. 2021. Better light spectral quality and thermal amplitude inside the greenhouse stimulate growth and improve acclimatization of in vitro grown Cattleya warneri T. Moore. In vitro Cellular and Developmental Biology-Plant. 57:883-896. Doi: https://doi.org/10.1007/s11627-021-10162-8.