elocation-id: e3175
Pseudomonas syringae pv. Tomato causa la peca bacteriana en el cultivo de tomate, provocando retraso en el crecimiento, maduración tardía en los frutos y pérdidas en el rendimiento. Para el control de este fitopatógeno se utilizan plaguicidas, los cuales se ha reportado que son una fuente de contaminación del suelo. Debido a que el uso de plaguicidas ha incrementado y con ello el impacto negativo, es necesario buscar alternativas eficientes y amigables con el medio ambiente. El agua electrolizada es una alternativa al uso de plaguicidas ya que ha mostrado tener efecto antimicrobiano. Es producida por electrólisis de soluciones diluidas de NaCl en una celda de electrólisis. En el presente trabajo se evaluó el efecto del agua electrolizada ácida (AEA) y alcalina (AEB) en cultivos de PstDC3000. El experimento se realizó en el laboratorio de Agrobiotecnología y Electroquímica perteneciente al Instituto Tecnológico de Tepic en el año 2020. Se aplicaron tratamientos con AEA y AEB al minuto 1, 3 y 6. Los resultados muestran la inhibición total de PstDC3000 con el tratamiento de AEA al minuto 1. Por otra parte, el tratamiento con AEB, logró disminuir 26.9%, 42.16% y 58.53 % UFC ml-1 al minuto 1, 3 y 6, respectivamente. Finalmente, se concluye que el agua electrolizada afecta el crecimiento de PstDC3000 y que el pH es un factor que influye en su actividad bactericida.
agua ácida, agua alcalina, antibacteriano.
Pseudomonas syringae pv. Tomato (PstDC3000) infecta las plantas de tomate y Arabidopsis thaliana (Cunnac et al., 2009; Zhao et al., 2003). En el cultivo de tomate, causa la enfermedad de la peca bacteriana. Aunque es un epifito débil, es un patógeno altamente agresivo una vez que se encuentra dentro de los tejidos del huésped (Xin y He, 2013). Esta bacteria sobrevive de manera epífita en las hojas, se puede encontrar en restos vegetales en el suelo y en las semillas secas y se activa durante la germinación (Beuzón y Ruiz, 2014). La bacteria entra en la planta a través de las estomas o por heridas, multiplicándose endofíticamente y asintomáticamente antes de desarrollar síntomas (Preston, 2000).
Además, PstDC3000 puede causar retraso en el crecimiento, maduración tardía en los frutos y pérdidas en el rendimiento, principalmente en plantas jóvenes infectadas (Preston, 2000). Debido al daño que causa la bacteria, el control de la enfermedad que provoca es de suma importancia. Para el control de enfermedades por fitopatógenos, en la agricultura se utilizan plaguicidas (SAGARPA, 2011), los cuales se ha reportado que son una fuente de contaminación del suelo y provocan su degradación (Sanaullah et al., 2020).
Debido a que el uso de plaguicidas ha incrementado y con ello el impacto negativo en los ecosistemas (Abhilash y Singh, 2009) y en la salud humana (Gomiero, 2018), es necesario buscar alternativas eficientes y amigables con el medio ambiente. El agua electrolizada es una alternativa al uso de plaguicidas que ha mostrado tener efecto antimicrobiano en bacterias y hongos (Rahman et al., 2016). Es producida por electrólisis de soluciones diluidas de NaCl en una celda de electrólisis, constituida por dos electrodos (ánodo y cátodo) y divididos por una membrana diafragmática (Fujiwara et al., 2009; Ovissipour et al., 2015).
Al final del proceso de electrólisis se obtiene agua electrolizada ácida en la parte anódica (Pangloli y Hung, 2011) con un pH de 2-3 y una concentración de cloro libre de 10-90 ppm (Hao et al., 2011) y agua electrolizada alcalina en la parte catódica (Shiroodi y Ovissipour, 2018) con un pH de 10-13 (Huang et al., 2008; Hao et al., 2011). El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del agua electrolizada ácida y alcalina en la reducción de las poblaciones bacterianas de PstDC3000 bajo condiciones in vitro.
El experimento se realizó en el laboratorio de Agrobiotecnología y Electroquímica perteneciente al Instituto Tecnológico de Tepic en los meses de agosto a diciembre del año 2020.
El agua electrolizada utilizada en este estudio fue el agua electrolizada ácida y agua electrolizada alcalina, las cuales fueron generadas mediante un equipo LeveLuck SD501 modelo TYH-401. El pH de los dos tipos de agua electroliza obtenida se determinó con un potenciómetro LAQUA-PC 1100 HORIBA Advanced Techno Co., Ltd. y la concentración de cloro libre (CCL) se determinó mediante un colorímetro marca HANNA modelo HI771.
La cepa de Pseudomonas syringae pv. Tomato PstDC3000 utilizada en este estudio fue obtenida del Instituto Tecnológico de Tepic. La cepa fue reactivada en medio sólido KB e incubada a 28°C durante 24 horas utilizando una incubadora marca Benchmark modelo Incu-Shaker 10LR. Para la obtención de la suspensión bacteriana se inocularon 50 ml de medio de cultivo líquido KB y se incubó a 28°C durante 24 h a 180 rpm para obtener un preinóculo. A partir del preinóculo se inocularon 50 ml de medio KB a una DO600= 0.05, se incubó a una temperatura de 28°C a 180 rpm por 24 horas.
Terminado el tiempo de incubación se tomaron 10 ml del medio de cultivo y se centrifugaron a 22 °C a 7 000 rpm durante 15 min utilizando una centrífuga marca Sigma modelo 2-16KL. Se decantó el sobrenadante y a la pastilla celular fue resuspendida en 10 ml de agua desionizada estéril. Se centrifugó a 22 °C a 7 000 rpm durante 15 min. Finalmente, la pastilla celular fue resuspendida el 10 ml de agua desionizada estéril.
Para la aplicación de los tratamientos se utilizó el protocolo sugerido por Ovissipour et al. (2015) con algunas modificaciones. Los tratamientos aplicados fueron agua electrolizada ácida, agua electrolizada alcalina y como control se utilizó agua destilada estéril. Primeramente, se colocaron 2 ml de la suspensión bacteriana en un tubo Falcón de 50 ml y se adicionaron 38 ml de agua electrolizada durante 1, 3 y 6 min a temperatura ambiente.
Terminado cada uno de los tiempos de tratamientos, se tomó 1 ml de la suspensión tratada y se adicionaron 1 ml de solución de NaCl al 0.85% y 1 ml de una solución de tiosulfato de sodio al 3%. En el caso del control, solo se adicionó 1 ml de NaCl al 0.85% y se homogenizó. Se tomaron 100 µl de las suspensiones tratadas y se realizaron diluciones en serie (10° - 106). Posteriormente, se tomaron alícuotas de 100 µl de cada dilución y se inocularon cajas Petri que contenían medio sólido KB y se incubaron a 28°C durante 48 h (cada uno de los tiempos de tratamiento se realizó por triplicado).
Terminado el tiempo de incubación se procedió realizar el conteo en placa y se calcularon las unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC ml-1). Para el análisis de los datos se realizó un ANOVA con un α= 0.05, seguida de una prueba de Tukey para la comparación de medias entre los tratamientos utilizando el software GraphPad Prism 7.
Los tratamientos con agua electrolizada se realizaron utilizando agua electrolizada ácida (AEA) con pH= 2.4 y una concentración de cloro libre (CCL) de 18 ±0.58 ppm y agua electrolizada alcalina (AEB) con pH= 10.2 y CCL= 0 ±0 ppm. Como control se utilizó agua destilada estéril (pH= 8.8 y CCL= 0 ±0). Los resultados de las células sobrevivientes de PstDC3000 después de la aplicación de los tratamientos se muestran en la Figura 1.
En la Figura 1 se puede observar que hay diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos (p< 0.05). Al aplicar el tratamiento con AEA se logró el 100% de la reducción de las poblaciones de PstDC3000 en un tiempo de tratamiento de 1 min, en comparación con el control de agua destilada estéril (9.8 x 107 UFC ml-1), además, como se observa, no hubo diferencias estadísticas significativas entre los diferentes tiempos de tratamiento con AEA (p> 0.05).
En un estudio realizado por Al-Qadiri et al. (2016) al aplicar agua electrolizada con una CCL= 60 y 120 ppm reportan que al incrementar el tiempo de tratamiento de 1 a 5 min y la concentración de cloro libre del agua electrolizada, se incrementa la reducción en el número de microorganismos. En el presente estudio no se observó ese efecto ya que al aplicar AEA con CCL= 18 ±0.58 ppm se logró la reducción del 100%.
Sin embargo, este efecto se observó al aplicar AEB (CCL= 0 ppm), ya que al minuto 1 se logró una reducción bacteriana del 26.9% en comparación con el control y esta reducción de microorganismos incremento con el tiempo de tratamiento a 58.53% observando diferencias estadísticas significativas entre los diferentes tiempos de tratamiento con AEB (P< 0.05).
Hao et al. (2016) reportaron que el AEA (CCL=60.43 ±0.34 ppm) y el agua electrolizada ligeramente ácida (CCL= 25.27 ±0.38 ppm) pueden tener una eficiencia antibacteriana equivalente; sin embargo, al diluirlas la eficiencia del AEA es menor en comparación con el agua electrolizada ligeramente ácida, sugiriendo que la concentración de cloro libre no es el principal factor que contribuye a la actividad antibacteriana del agua electrolizada.
En este sentido y de acuerdo a los resultados obtenidos, se sugiere que la concentración de cloro no es el factor principal en la reducción de las poblaciones bacterianas ya que se logró reducir las poblaciones bacterianas con los dos tipos de agua. Por otra parte, se observó que el tiempo de tratamiento al aplicar AEA, no es un factor que influya en la actividad bactericida, pero si tuvo influencia con el tratamiento de AEB, lo que sugiere que el pH es el factor que más influyó ya que al aplicar AEA (pH= 2.4) se logró una inhibición del 100% de las poblaciones bacterianas en comparación de AEB (pH= 10.2) y el tratamiento control (pH = 8.8).
Para determinar si el pH del agua electrolizada ácida o alcanina ejerce algún efecto sobre la capacidad del agua electrolizada para reducir el número de microorganismos, se generó el diagrama de Pareto y la superficie de respuesta evaluando las variables tiempo y pH del agua electrolizada. En la Figura 2a se presenta el diagrama de Pareto que muestra que tanto el pH del agua electrolizada como el tiempo de tratamiento, influyen sobre el crecimiento de PstDC3000 (p< 0.05) y que el factor pH es el factor que más efecto tiene.
En la Figura 2b se presenta la superficie de respuesta, donde se muestra que a un valor de pH de 2.4, correspondiente a AEA, se logra eliminar completamente a las poblaciones PstDC3000 en un minuto tratamiento y a un valor de pH de 10.2 se logra una reducción de 26.9%, 42.16% y 58.53% UFC ml en un tiempo de tratamiento de 1, 3 y 6 min, respectivamente.
Sun et al. (2012) reportaron una reducción del 95% de las poblaciones de S. aureus en un tiempo de tratamiento de 2 min al aplicar AEA con pH de 2.5. Un efecto similar fue observado en el presente estudio, donde se observó una reducción del 100% al aplicar AEA con pH= 2.4 en un tiempo de tratamiento de 1 min. Sin embargo, los autores reportan que AEB es menos eficiente en la reducción del número de bacterias.
En el presente estudio se observó que el AEB, efectivamente, es menos eficiente que el AEA; sin embargo, con un tiempo de tratamiento de 5 min, se logró reducir hasta un 58.53%. Por otra parte, en un estudio realizado por Issa-Zacharia et al. (2010) reportaron una mayor reducción de E. coli, Salmonella spp y S. aureus al aplicar tratamientos con AEA (pH= 2.6) en comparación con agua ligeramente ácida con pH de 5.6 y una solución de NaClO con pH de 9.1.
Rahman et al. (2016) comentan que las bacterias crecen en un rango de pH de 4-9. También comentan que la actividad antimicrobiana del agua electrolizada depende de su pH y que este valor determina las especies de cloro disponibles en esta, además de que un pH bajo reduce el crecimiento microbiano debido a que hace a las células bacterianas más sensibles al cloro activo.
En el presente estudio se aplicó un tratamiento de AEA con pH de 2.4 y se obtuvo una mayor reducción en comparación con el tratamiento de AEB (pH= 10.2) y el control (pH= 8.8), sugiriendo que a pH bajo (por debajo de 4) se logra afectar el crecimiento bacteriano. Además de que el pH junto con las concentraciones de cloro libre presentes en AEA pudieron haber ejercido un efecto sinérgico en la reducción de las poblaciones bacterianas.
El agua electrolizada ácida y alcalina poseen actividad antibacteriana ya que los dos tipos de agua afectaron el crecimiento de PstDC3000. Sin embargo, aunque AEB mostró tener efecto antimicrobiano, este fue menor en comparación con el observado con AEA por lo que es necesario incrementar el tiempo de tratamiento para reducir el número de microorganismos. Por otra parte, los factores pH y tiempo de tratamiento contribuyeron en la reducción bacteriana, siendo el pH el factor que más influyó en su actividad antimicrobiana.
Al-Qadiri, H. M.; Al-Holy, M. A.; Shiroodi, S. G.; Ovissipour, M.; Govindan, B. N.; Al-Alami, N. and Rasco, B. 2016. Effect of acidic electrolyzed water-induced bacterial inhibition and injury in live clam (Venerupis philippinarum) and mussel (Mytilus edulis). International Journal of Food Microbiology. 23:48-53. Doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2016.05.012.
Ovissipour, M.; Al-Qadiri, H. M.; Sablani, S. S.; Govindan, B. N.; Al-Alami, N. and Rasco, B. 2015. Efficacy of acidic and alkaline electrolyzed water for inactivating Escherichia coli O104:H4, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophila and Vibrio parahaemolyticus in cell suspensions. Food Control. 53:117-123. Doi: 10.1016/j.foodcont.2015.01.006.