Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas   volumen 13   número 6   14 de agosto - 27 de septiembre, 2022

DOI: https://doi.org/10.29312/remexca.v13i6.3030

Artículo

Identificación de hongos endófitos de Ageratina pichinchensis con actividad antagónica contra fitopatógenos de importancia agrícola

Valeria Camacho-Luna1

Aida Aracelí Rodríguez-Hernández2

Mario Rodríguez-Monroy1

Robledo Norma3

Gabriela Sepúlveda-Jiménez1§

1Departamento de Biotecnología-Centro de Desarrollo de Productos Bióticos-Instituto Politécnico Nacional. Calle CEPROBI núm. 8, colonia San Isidro, Yautepec, Morelos, México. CP. 62731. (vcamachol1100@alumno.ipn.mx; mrmonroy@ipn.mx).

2CONACYT-Instituto Politécnico Nacional- Centro de Desarrollo de Productos Bióticos. Calle CEPROBI núm. 8, colonia San Isidro, Yautepec, Morelos, México. CP. 62731. (arodriguezhe@ipn.mx).

3Departamento de Interacciones Planta-Insecto-Centro de Desarrollo de Productos Bióticos-Instituto Politécnico Nacional. Calle CEPROBI núm. 8, colonia San Isidro, Yautepec, Morelos, México. CP. 62731. (nrobledo@ipn.mx).

§Autora para correspondencia: gsepulvedaj@ipn.mx.

Resumen

Ageratina pichinchensis es una planta medicinal, endémica de México conocida como Axihuitl. Los extractos de las hojas muestran actividad antifúngica contra hongos dermatofitos, pero no hay estudios de la identificación de los hongos endófitos. El objetivo fue identificar hongos endófitos de A. pichinchensis con potencial como agentes de control biológico de fitopatógenos. De las hojas de A. pichinchensis se aislaron 55 morfoespecies de hongos endófitos que pertenecen al filo Ascomycota. La identificación molecular basada en el análisis de las secuencias de los espaciadores internos transcritos (ITS) amplificadas por PCR mostró que seis de los hongos más frecuentes corresponden a Remotididymella anthropophila y Diaporthe caatingaensis y a los géneros Diaporthe, Phomopsis y Fusarium. En ensayos de antagonismo múltiple, siete morfoespecies mostraron actividad antagónica fuerte contra los patógenos Fusarium oxysporum, F. proliferatum y Stemphylium vesicarium dos hongos endófitos pertenecen a Alternaria alternata, otro a Trichoderma longibrachiatum y otros dos son de los géneros Alternaria y Phomopsis. Mientras que Nigrospora oryzae fue el único endófito más frecuente y con actividad antagónica contra los tres patógenos. En ensayos de cultivo dual, los endófitos con actividad antagónica fuerte inhibieron de 37 al 80% el crecimiento micelial de F. oxysporum y F. proliferatum, pero en el ensayo de alimento envenenado, T. longibrachiatum inhibió el crecimiento micelial de los dos patógenos en 79 y 66%, respectivamente. Por primera vez se reporta a R. anthropophila como un hongo endófito, así como la identificación y la actividad antagónica de hongos endófitos de A. pichichensis.

Palabras clave: Fusarium, Nigrospora, Remotididymella, Trichoderma, biocontrol.

Recibido: abril de 2022

Aceptado: junio de 2022

Introducción

Los microorganismos endófitos son aquellos que colonizan los tejidos de las plantas, pero sin causar síntomas visibles de enfermedad (Hardoim et al., 2015). En extractos de plantas medicinales, la actividad antimicrobiana se relaciona con la proporción de endófitos, (Egamberdieva et al., 2017). Por lo que, los hongos endófitos de las plantas medicinales podrían usarse como agentes de biocontrol de fitopatógenos.

La planta medicinal Ageratina pichinchensis (Kunth) R.M. King & H. Rob (anteriormente llamada Eupatorium aschembornianum S. Schauer) es endémica de México y es una hierba perenne silvestre que crece en las áreas boscosas en 28 de los 32 estados mexicanos (Rzedowski y Rzedowski, 2001). En el estado de Morelos, se le conoce como Axihuitl y crece en el área natural protegida del Corredor Biológico Chichinautzin. Es una planta que se utiliza en la medicina tradicional para tratar úlceras gástricas, infecciones cutáneas, heridas y tumores (Avilés y Suárez, 1994). Los extractos de las hojas tienen actividad antifúngica contra los hongos dermatofitos Candida albicans y Aspergillus niger (Ríos et al., 2003). Sin embargo, los estudios de la identificación de los hongos endófitos de A. pichinchesis con actividad antagónica contra fitopatógenos son escasos.

Los hongos del género Fusarium y Stemphylium causan enfermedades en diversos cultivos. Fusarium oxysporum causa la marchitez vascular o pudrición de la raíz en cultivos como alfalfa, frijol, algodón, lechuga, cebolla, chícharos, pimiento, papa, soja, espinaca, y tomate (Munkvold, 2017). F. proliferatum es un componente del complejo de la pudrición de la mazorca y del tallo en el maíz, en espárragos, bananos, palmeras datileras, higos, mangos, pinos, sorgo y cebollas (Munkvold, 2003). Stemphylium vesicarium es el agente causal de la enfermedad tizón foliar en cebolla y ajo (Rao y Pavgi, 1975; Zapata-Sarmiento et al., 2020) y también afecta los espárragos, haba y arroz (Sheikh et al., 2015; Graf et al., 2016; Foster et al., 2019). Por lo cual, el objetivo de este estudio fue la identificación de hongos endófitos de A. pichinchensis con potencial para el control biológico de fitopatógenos del género Fusarium y Stemphylium.

Materiales y métodos

Colecta de material vegetal

Las plantas de Ageratina pichinchensis se colectaron en octubre de 2019 en el Corredor Biológico Chichinautzin, Morelos, México, coordenadas geográficas 18° 59’ 26.4” latitud norte 99°17’09.2” longitud oeste. Un ejemplar se depositó en el herbario HUMO de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos (Voucher 3571) y las plantas se identificaron por personal capacitado de la misma institución. Las plantas tenían 1 m de altura y estaban en etapa de floración. En total se colectaron 40 hojas sin síntomas de enfermedad de 20 plantas, dos hojas por cada planta.

Aislamiento de hongos endófitos y su clasificación en morfoespecies

Los hongos endófitos se aislaron y clasificaron en morfoespecies de acuerdo con Arnold et al. (2001). De las hojas se cortaron cinco fragmentos de 5 mm2 y la superficie de los fragmentos se desinfectó con etanol (70%) por 2 min, con hipoclorito de sodio (0.52%) por 2 min y dos lavados con agua destilada estéril.

Para evaluar la eficacia de la desinfección, de cada fragmento se obtuvo una impresión en medio de cultivo de papa, dextrosa y agar (PDA, Bioxon) en cajas Petri, que se incubaron por ocho días. La ausencia de crecimiento micelial indicó que el método de desinfección fue efectivo para eliminar los hongos epifitos. Al mismo tiempo, los cinco fragmentos se secaron y se colocaron en cajas Petri con medio de cultivo de PDA. Las cajas Petri se incubaron a 27 ±2 °C con un fotoperiodo de 12 h luz: 12 h oscuridad hasta observar el crecimiento de las hifas. Las puntas de las hifas se subcultivaron para obtener colonias puras en cajas Petri con PDA.

Los hongos se clasificaron en morfoespecies de acuerdo con las siguientes características morfológicas: producción de esporas, micelio aéreo, color de la colonia, color del medio de cultivo, textura de la superficie y características del borde. La frecuencia relativa (FR) de cada morfoespecie se calculó con Photita et al. (2001) y la fórmula:

 .

Ensayo de antagonismo múltiple

Previamente, los aislados de F. oxysporum, F. proliferatum se obtuvieron de bulbos de cebolla y el aislado de S. vesicarium se obtuvo de hojas de cebolla. Previo a realizar los ensayos, los hongos patógenos como los endófitos se cultivaron en medio de PDA (Bioxon), a 27 ±2 °C con un fotoperiodo de 12 h luz:12 h oscuridad por siete días.

La actividad antagónica de cada morfoespecie contra los tres fitopátogenos se evaluó en un ensayo de antagonismo múltiple descrito por Sánchez-Fernández et al. (2015). Para cada endófito en confrontación múltiple y los controles se hicieron tres repeticiones. Los resultados se analizaron por triplicado mediante el análisis de conglomerados con el paquete ‘fastcluster’ de la versión 3.4.2 de Rstudio. La actividad antagónica se clasificó de acuerdo con la escala modificada de Yuen et al. (1999) como: a) fuerte, el hongo endófito inhibe el crecimiento de los patógenos y crece hasta el patógeno y lo rodea; b) débil, el hongo endófito y el patógeno crecen y sus hifas se entremezclan y no reducen su crecimiento; c) mutuo, el hongo endófito y el patógeno crecen hasta el contacto y dejan de crecer; y d) nulo, el patógeno crece hasta el endófito, lo rodea e inhibe su crecimiento.

Identificación molecular de los hongos endófitos con la mayor actividad antagónica

Los hongos endófitos que se encontraron con una FR mayor al 5% y que en el ensayo de antagonismo múltiple mostraron una actividad antagónica fuerte se cultivaron en medio PDA (Difco) por siete días. El micelio se colectó, se congeló y pulverizó en un mortero con N2 líquido. Para la purificación de ADN se empleó el Dneasy Plant Mini Kit (Quiagen, Germany). Las regiones ITS de los hongos se amplificaron utilizando los primers ITS 1 (5’ TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’) e ITS4 (5’ CTGTTGGTTTCTTTTCCTCCGC 3’) diseñados por White et al. (1990). Las condiciones de amplificación fueron las reportadas por Zapata-Sarmiento et al. (2020).

La secuenciación se realizó por la empresa Macrogen Inc Services (Seoul, Corea). La secuencia consenso se obtuvo con el software BioEdit Program (versión 7.0.5) y las secuencias se depositaron en el GenBank con el programa Blast de la base de datos del National Center for Biotechnology Information. En base a los resultados del análisis de Blast, para asignar un nombre a una especie se consideró una identidad ≥98 a 100% y una cobertura ≥80% con otras secuencias. A las secuencias que no cumplían con dichos criterios se asignó el nombre a nivel de género.

Ensayo de cultivo dual

Los hongos endófitos con actividad antagónica fuerte se seleccionaron para evaluar su actividad antagónica en ensayos de cultivo dual contra F. oxysporum y F. proliferatum de acuerdo a Zapata-Sarmiento et al. (2020). Para cada hongo endófito en cultivo dual con cada patógeno y los controles se realizaron seis repeticiones. Cada 24 h se tomaron fotografías de los cultivos y las imágenes se analizaron utilizando el programa ImageJ (versión 1.8) para calcular el área (cm2) de crecimiento micelial del patógeno.

El porcentaje de inhibición del crecimiento micelial (ICM) se calculó mediante la ecuación: . Donde: C= corresponde al área del crecimiento micelial del patógeno en el control;y T= área del crecimiento micelial en el cultivo dual.

Los datos se analizaron mediante un análisis de varianza (Anova) y la comparación de medias mediante la prueba de Tukey en Rstudio (versión 1.2.1335) con la librería Agricolae. El tipo de interacción entre el hongo endófito y el fitopatógeno se registró después de 15 días de incubación. De acuerdo con Bertrand et al. (2013), las interacciones se clasificaron en: inhibición a distancia, zona de líneas, inhibición al contacto y sobrecrecimiento.

Ensayo de actividad antagónica de los metabolitos no volátiles

La actividad antagónica de los filtrados libres de células de los hongos endófitos Trichoderma longibrachiatum-EA54 y Nigrospora oryzae-EA51 contra F. oxysporum y F. proliferatum se evaluó mediante la técnica de cultivo envenenado con Schmitz (1930). T. longibrachiatum y N. oryzae se cultivaron en cajas de Petri con medio de PDA (Difco TM) por siete días. Con el cultivo de T. longibrachiatum se preparó una suspensión de esporas a una concentración de 1x107 esporas ml-1. En matraces Erlenmeyer (250 ml) con 50 ml de caldo papa dextrosa (CPD, Difco TM) se añadió 1.5 ml de la suspensión de esporas. Debido que N. oryzae en medio de cultivo de PDA carece de estructuras reproductivas, los matraces se inocularon con cinco bloques de medio de cultivo con micelio de 0.5 cm de diámetro. De cada hongo se prepararon tres matraces Erlenmeyer.

Los cultivos líquidos se incubaron en un agitador a 150 rpm y a 27 ±2 °C con un fotoperiodo de 12 h luz: 12 h oscuridad. Después de cuatro días, se colectó el caldo de cultivo y se centrifugó a 4 500 rpm por 10 min; el sobrenadante se filtró a través de membranas de 0.45 µm y luego de 0.22 µm (GVWP, Millipore) para obtener el filtrado libre de células que se usó para preparar el medio de cultivo de acuerdo con Zapata-Sarmiento et al. (2020). Para cada patógeno con cada filtrado libre de células y los respectivos controles se prepararon seis cajas Petri. Cada 24 h se tomaron fotografías y las imágenes se analizaron con el programa ImageJ (versión 1.8) para calcular el área (cm2) de crecimiento micelial del patógeno. El porcentaje de inhibición del crecimiento micelial (ICM) se calculó con la ecuación:ICM= (C-T) × 100 ÷ C.

Resultados y discusión

Clasificación y frecuencia de las morfoespecies de los hongos endófitos

A partir de las hojas de A. pichinchensis, se obtuvieron 100 aislados de hongos endófitos. Con base en las características morfológicas, los aislados se clasificaron en 55 morfoespecies. El aislado EA38 fue la morfoespecie más frecuente con una frecuencia relativa (FR) de 20%; seguido de los aislados EA37, EA39 y EA40 con una FR de 15% y luego los aislados EA30, EA42 y EA51 con una FR de 10%. Los aislados restantes presentaron una FR de 5%. La morfoespecie es un término taxonómico funcional útil para clasificar a los hongos endófitos, que son muy diversos en plantas que crecen en ambientes tropicales. Esta clasificación también es útil para identificar endófitos que carecen de estructuras reproductivas cuando se cultivan in vitro (Fröhlich y Hyde, 1999; Arnold et al., 2001). Por esto se decidió utilizar esta clasificación para hongos endófitos de A. pichinchensis.

Actividad antagónica de las morfoespecies de hongos endófitos en bioensayos de antagonismo múltiple

El análisis de conglomerados agrupó a las 55 morfoespecies de hongos endófitos de acuerdo con su actividad antagónica contra S. vesicarium, F. proliferatum y F. oxysporum. Siete morfoespecies (EA26, EA51, EA28, EA10, EA53, EA55 y EA54) mostraron actividad antagónica fuerte contra los tres patógenos. Mientras que, el crecimiento micelial de S. vesicarium fue fuertemente inhibido por 12 hongos endófitos y débilmente inhibido por seis. La inhibición mutua del crecimiento micelial con los tres patógenos se observó con los aislados EA2 y EA37, pero el aislado EA48 fue el único que mostró una inhibición mutua con S. vesicarium (Figura 1).

Figura 1. Análisis de conglomerados de la actividad antagónica (fuerte, mutua, débil o nula) de los hongos endófitos de Ageratina pichinchensis contra Fusarium oxysporum, Fusarium proliferatum y Stemphylium vesicarium.

En la Figura 2 se muestra las interacciones que se observaron entre las siete morfoespecies de hongos endófitos clasificados con fuerte actividad antagónica contra los patógenos. Las morfoespecies de los aislados EA10, EA28 y EA54 crecieron sobre el micelio de los patógenos. Mientras que EA26, EA51, EA53 crecieron alrededor de los patógenos y la morfoespecie EA55 creció sobre S. vesicarium y sólo creció alrededor de las dos especies de Fusarium.

Figura 2. Interacciones observadas en el ensayo de antagonismo múltiple de las siete morfoespecies de los hongos endófitos de Ageratina pichinchensis clasificados con fuerte actividad antagónica frente a los patógenos: a) Fusarium oxysporum; b) Fusarium proliferatum; y c) Stemphylium vesicarium.

De las 55 morfoespecies de los hongos endófitos que se aislaron de A. pichinchensis, 12 de ellas mostraron actividad antagónica contra un patógeno y siete contra los tres patógenos. En forma similar se reportan el aislamiento de morfoespecies de hongos endófitos de plantas medicinales con actividad antagónica contra hongos patógenos. En Etlingera elatior (jengibre) se reporta el aislamiento de seis morfoespecies de hongos endófitos con actividad antagónica contra Fusarium oxysporum, Ganoderma boninense y Rigidoporus lignosus (Lutfia et al., 2020) y en Aloe dhufarensisi se aislaron dos morfoespecies de hongos endófitos con actividad antagónica contra Fusarium sp. y Cladosporium sp (Al-Rashdi et al., 2020).

En base a los resultados del ensayo de antagonismo múltiple, se seleccionaron las siete morfoespecies de hongos endófitos con actividad antagónica fuerte para su identificación a nivel molecular y para realizar los ensayos de actividad antagónica en cultivo dual y de alimento envenenado.

Identificación de los hongos endófitos con actividad antagónica fuerte contra patógenos

En el Cuadro 1 se muestra la identificación a nivel molecular de los 12 aislados de hongos endófitos que se encontraron con una FR mayor al 5% y que además presentaron una actividad antagónica fuerte. Las secuencias de los aislados EA30 y EA40 cumplieron con el criterio de identidad (≥ 98%) y cobertura (> 80%) que corresponden a secuencias de Remotididymella anthropophila y Diaporthe caatingaensis, respectivamente. La secuencia del aislado EA37 también cumplió con el criterio de identidad y cobertura, pero es con una secuencia del banco de genes de una especie no identificada del género Phomosis. Para los aislados EA38 y EA39 el valor de identidad fue menor al 98%, por lo cual se ubicaron en el género Diaporthe.

Cuadro 1. Identificación molecular de los hongos endófitos de Ageratina pichinchensis con una frecuencia relativa (FR) mayor al 5% y que presentaron fuerte actividad antagónica contra los patógenos Fusarium oxysporum, Fusarium proliferatum y Stemphylum vesicarium.

Para el caso del aislado EA42, la identidad fue de 92.2% y por lo tanto, también sólo se ubicó en el género Fusarium. El aislado EA51 con una FR mayor al 5% y con actividad antagonista contra todos los patógenos mostró una identidad 99.8% con secuencias de Nigrospora oryzae. Los aislados de los hongos EA10 y EA28 con actividad antagónica mostraron una identidad mayor al 99% con secuencias de especies de Alternaria alternata. La secuencia del aislado EA26 mostró una identidad 99.8% con una especie no identificada del género Alternaria y las secuencias de los aislados EA54 y EA55 presentaron una identidad del 99 y 99.5% con secuencias de Trichoderma longibrachiatum y Phomopsis sp., respectivamente. Finalmente, el aislado EA53 fue el único que no se identificó a nivel molecular, pero en medio PDA no desarrolló estructuras reproductivas, presentó micelio aéreo, la colonia mostró una textura polvorienta, con margen irregular, con anillos y de color blanco.

 Los hongos endófitos pertenecen a los órdenes Pleosporales, Trichophaeriales, Diapothales e Hypocreales. De acuerdo con la identificación molecular y los datos de la frecuencia relativa, el género Phomopsis (anamorfo de Diaporthe) fue el más frecuente seguido de Fusarium sp., N. oryzae y R. anthropophila. Algunas de las especies de hongos endófitos que se identificaron en A. pichinchensis también se reportan en otras especies de plantas del género Ageratina. Los hongos endófitos más abundantes en A. adenophora pertenecen al género Phomopsis (Mei et al., 2014), mientras que P. magnolia y N. oryzae también se reportan como endófitos de A. altissima (Christian et al., 2016). Los hongos del género Phomopsis son los endófitos que con más frecuencia se aíslan en especies de plantas tropicales (Murali et al., 2006).

El hongo N. oryzae es un endófito con una distribución cosmopolita y una amplia gama de hospederos (Wang et al., 2017). El hongo R. anthropophila no se ha reportado como endófito en otras plantas; pero, este hongo pertenece a la familia Didymellaceae, que incluye otras especies de hongos reportados como endófitos y fitopatógenos (Wang et al., 2017). Similar a nuestros resultados, los hongos del género Alternaria y Diaporthe se reportan como endófitos de la planta medicinal Ocimum sanctum Linn. y también muestran actividad antagónica contra F. oxysporum (Chowdhary y Kaushik, 2015). Sin embargo, no hay reportes de la actividad antagónica de Alternaria sp. y Phomopsis sp. contra F. proliferatum y S. vesicarium. Con respecto a N. oryzae, se reporta que es un endófito de Gossypium arboreum (algodón) con actividad antagónica contra F. solani (Hiremani et al., 2020), pero no hay reportes de la actividad antagónica de Nigrospora contra otras especies de Fusarium y S. vesicarium.

Actividad antagónica de hongos endófitos en ensayos de cultivo dual

En cultivo dual, los siete aislados de hongos endófitos seleccionados inhibieron el crecimiento micelial de F. oxysporum y F. proliferatum de 37 al 80%. Los aislados de T. longibrachiatum y N. oryzae mostraron la mayor actividad antagónica, ya que en más 79% inhibieron el crecimiento de las dos especies de Fusarium (Cuadro 2).

Cuadro 2. Actividad antagónica de los hongos endófitos de Ageratina pichinchensis contra Fusarium oxysporum y Fusarium proliferatum en ensayos de cultivo dual.

Cada valor corresponde a la media ± desviación estándar (n= 5). Valores en la misma columna seguidos por diferentes letras difieren significativamente de acuerdo con la prueba HSD de Tukey (p< 0.05). ICM= inhibición del crecimiento micelial; CM= crecimiento micelial.

En relación con T. longibrachiatum, se reporta que inhibe el crecimiento de F. oxysporum de un 27.2 a 68.7% (Sundaramoorthy y Balabaskar, 2013; Abdelrahman et al., 2016; Zhang et al., 2018). En este estudio, se encontró que el aislado de T. longibrachiatum inhibió el crecimiento de F. oxysporum hasta 80%. En contraste, no existen reportes sobre la actividad antagónica de T. longibrachiatum contra F. proliferatum. Pero otras especies de Trichoderma, como T. harzianum y T. gamsii inhiben el crecimiento de F. proliferatum en 80% (Mondani et al., 2021), similar a lo reportado en este estudio.

En el caso de N. oryzae, los estudios de la inhibición del crecimiento de hongos del género Fusarium son escasos. El porcentaje de inhibición del crecimiento de F. oxysporum y F. proliferatum que se encontró en este estudio es mayor al reportado (43.06%) contra F. solani. (Hiremani et al., 2020). Mientras que, N. oryzae es un endófito de Tylophora indica que no muestra actividad antagónica contra F. oxysporum (Kumar et al., 2010). Para F. proliferatum no existen estudios de la actividad antagónica de N. oryzae. En la Figura 3 se muestran los tipos de interacción entre los hongos endófitos y los patógenos Fusarium oxysporum y Fusarium proliferatum.

Figura 3. Tipos de interacción entre los hongos endófitos de Ageratina pichinchensis y los fitopatógenos Fusarium oxysporum y Fusarium proliferatum en ensayos de cultivo dual.

En la interacción de F. oxysporum y F. proliferatum con A. alternata EA10, Alternaria sp. EA26, Phomopsis sp. EA55 y EA53 (no identificado) se observó la formación de una zona de líneas. El tipo de interacción entre A. alternata EA28 y los dos patógenos fue diferente dependiendo de la especie de Fusarium. Con F. oxysporum se observó una zona de líneas mientras que con F. proliferatum se observó sobrecrecimiento del endófito sobre el micelio del patógeno. Por el contrario, N. oryzae creció sobre el micelio de F. oxysporum pero con F. proliferatum desarrolló una zona de líneas. Trichoderma longibrachaitum creció sobre ambos patógenos y también esporuló sobre ellos.

La presencia de una zona de líneas indica que el mecanismo de la actividad antagónica es la antibiosis (Bertrand et al. 2013), por lo que se sugiere que A. alternata EA10, Alternaria sp. EA26, Phomopsis sp. EA55 y el aislado EA53 producen antibióticos contra Fusarium.

En la interacción de ‘sobrecrecimiento’, puede involucrar además de la antibiosis, una competencia por nutrientes y espacio (Bertrand et al., 2013). Por lo cual, los resultados en cultivo dual y del tipo de interacción indican que la actividad antagónica de T. longibrachiatum con las dos especies de Fusarium es la antibiosis y la competencia. Sin embargo, los resultados sobre el tipo de interacción de los hongos N. oryzae y A. alternata EA28 contra las dos especies de Fusarium indican que los mecanismos de interacción dependen de la especie del patógeno. En base a los resultados del ensayo de cultivo dual y los tipos de interacción, se seleccionaron T. longibrachiatum y N. oryzae para realizar los ensayos de alimento envenenado.

Actividad antagónica de metabolitos no volátiles de Trichoderma sp. y N. oryzae contra F. oxysporum y F. proliferatum

Los filtrados libres de células de N. oryzae no inhibieron el crecimiento de F. oxysporum y F. proliferatum. Sin embargo, Trichoderma sp., inhibió el crecimiento micelial de ambos patógenos; F. proliferatum se inhibió 66.5% y F. oxysporum en 79.5% (Cuadro 3).

Cuadro 3. Actividad antifúngica de los filtrados de los cultivos líquidos de Trichoderma sp. y Nigrospora oryzae contra Fusarium oxysporum y Fusarium proliferatum.

Cada valor corresponde a la media ± desviación estándar (n= 5). Valores en la misma columna seguidos por diferentes letras difieren significativamente de acuerdo con la prueba HSD de Tukey (p< 0.05). ICM= inhibición del crecimiento micelial; CM= crecimiento micelial.

La técnica del alimento envenenado confirmó que la actividad antagónica de N. oryzae no se debió a la producción de antibióticos y que N. oryzae inhibe el crecimiento de las dos especies de Fusarium por competencia de espacio y nutrientes. Por el contrario, los resultados con T. longibrachiatum indican que es un hongo endófito que inhibió el crecimiento de las dos especies de Fusarium por la producción de compuestos con actividad antibiótica.

De manera similar, otros autores reportan la actividad antagónica de Trichoderma contra cepas de F. oxysporum, pero los estudios sobre la actividad antagónica de T. longibrachiatum contra F. proliferatum son escasos. En base a nuestros resultados la inhibición del crecimiento por los compuestos producidos por T. longibrachiatum fue mayor contra F. oxysporum que contra F. proliferatum. Los estudios futuros podrían enfocarse en caracterizar los metabolitos no volátiles producidos por Trichoderma longibrachiatum y evaluar la efectividad contra los dos patógenos.

Las cepas de T. longibrachiatum se han aislado de suelo de la rizosfera de un sitio forestal (Zhang et al., 2018), de suelo desértico de Egipto (Abdelrahman et al. 2016) y de la rizosfera de Solanum lycopersicum L. (tomate) (Sundaramoorthy y Balabaskar, 2013). Pero los estudios sobre la actividad antagónica de Trichoderma aislada de hojas y partes aéreas de plantas medicinales son escasos. Sarsaiya et al. (2020) reportaron que T. longibrachiatum aislada de segmentos de tallo de Dendrobium nobile produce dendrobina, un compuesto similar al producido por la planta hospedera y que muestra actividad antibacteriana. Asimismo, T. longibrachiatum aislada de la raíz de Suaeda glauca, una planta marina, produce sesquiterpenos y ciclodepsipéptidos con actividad antagónica contra patógenos del suelo (Du et al., 2020). Estos estudios muestran el uso potencial de cepas de Trichoderma aisladas de planta medicinales con fines agrícolas. Los estudios futuros estarán dirigidos a identificar y caracterizar los metabolitos producidos por Trichoderma longibrachiatum aislada de hojas de A. pichinchensis con actividad antifúngica contra patógenos.

Conclusiones

Los hongos endófitos más frecuentes de A. pichinchensis pertenecen al filo Ascomycota e incluyen a Remotididymella anthropophila y Diaporthe caatingaensis, y otros que pertenecen a los géneros Diaporthe, Phomopsis y Fusarium. Los hongos endófitos con actividad antagónica fueron Alternaria alternata y Trichoderma longibrachiatum y otros que pertenecen a los géneros de Alternaria y Phomopsis. El único hongo endófito frecuente y que presentó actividad antagónica es N. oryzae, que juntó con T. longibrachoatum sobresalen por su actividad antagónica contra F. oxysporum y F. proliferatum. Pero difieren en su mecanismo de actividad antagónica, en T. longibrachiatum se debe a la producción de compuestos con actividad antibiótica, mientras que la actividad de N. oryzae se debe a la competencia de espacio y nutrientes. Este es el primer reporte de R. anthropophila como un hongo endófito y de la identificación y la actividad antagónica de hongos endófitos de hojas de A. pichichensis.

Agradecimientos

La investigación contó con el apoyo económico de la Secretaría de Investigación y Posgrado del Instituto Politécnico Nacional (proyecto 20220769). A Gabriel Flores Franco (Herbario HUMO, Universidad Autónoma del Estado de Morelos) por la identificación de las plantas. VCL recibió beca doctoral de CONACYT (México) y del programa de Beca de Estímulo Institucional de Formación de Investigadores (BEIFI-IPN). GSJ y MRM son becarios EDI y COFAA.

Literatura citada

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