Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas   publicación especial número 24   15 de abril - 30 de mayo, 2020

DOI: https://doi.org/10.29312/remexca.v0i24.2364

Artículo

Rendimiento de forraje de pasto ovillo inoculado con bacterias PGPB

María Myrna Solís-Oba1

Gisela Aguilar-Benítez2

Rigoberto Castro-Rivera1§

Yuri Villegas-Aparicio3

Job Jonathan Castro-Ramos1

Aida Solís-Oba4

1Instituto Politécnico Nacional-Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada. Ex Hacienda de San Juan Molino, Carretera Tecuexcomac-Tepetitla km 1.5, Tlaxcala. CP. 90700. (mirobatlx@hotmail.com; jonathan-castro@live.com.mx). 2Instituto de Investigación de Zonas Desérticas-Universidad Autónoma de San Luís Potosí. Altair 200, Colonia del Llano, San Luis Potosí. CP. 78377. (gisela.aguilar@uaslp.mx). 3Instituto Tecnológico del Valle de Oaxaca-División de Estudios de Posgrado. Ex Hacienda de Nazareno, Santa Cruz Xoxocotlán, Oaxaca, México. CP. 71230. (yuriva1968@gmail.com). 4División de Ciencias Biológicas y de la Salud-Universidad Autónoma Metropolitana-Unidad Xochimilco. Calzada del Hueso 1100, Colonia Villa Quietud, Delegación Coyoacán, Ciudad de México, México. CP. 04960. (asolis@correo.xoc.uam.mx).

§Autor para correspondencia: rcastror@ipn.mx.

Resumen

Las bacterias PGPB tienen efectos benéficos en el rendimiento de los cultivos. El objetivo del presente estudio fue determinar el efecto de cinco bacterias promotoras del crecimiento vegetal sobre el rendimiento, altura de planta, unidades SPAD y contenido de proteína de pasto ovillo defoliado cada cinco semanas en primavera y verano, bajo condiciones de invernadero. Se utilizó un diseño completamente al azar, con arreglo factorial 5 x 2 x 2, siendo la unidad experimental una maceta con diez tallos, con cuatro repeticiones.  Las bacterias evaluadas fueron: Ewingella americana (digestato), Ewingella americana (suelo), Pseudomonas clororaphis, Bacillus toyonensis y Microbacterium oxidans, comparados entre sí y con los controles positivo (triple 17) y negativo (suelo sin fertilización). Los valores altos de MS en primavera lo registraron E. americana (3.5 g MS maceta-1), mientras que en verano fue B. Toyonensis. Los valores de altura no registraron diferencias (p> 0.05) en ambas épocas, las unidades SPAD solo en el verano y E. americana registró los menores valores (1.8). El contenido de proteína evidenció que los testigos fueron inferiores a todos los tratamientos que fueron inoculados. Las bacterias estudiadas registraron efectos en todas las variables evaluadas y fueron superiores a la fertilización inorgánica y al suelo sin fertilizar.

Palabras clave: Bacillus toyonensis, Ewingella americana, Microbacterium oxidans y Pseudomonas clororaphis.

Recibido: enero de 2020

Aceptado: marzo de 2020

Introducción

Los microorganismos rizoféricos colonizan la rizosfera y mejoran el desarrollo de las plantas, promoviendo un uso eficiente de los minerales, mediante una amplia variedad de mecanismos como la mineralización de la materia orgánica, el control biológico contra patógenos del suelo, la fijación biológica de N, P, K y Zn, entre otros micronutrientes y sintetizan sideroforos, lo que fomenta el desarrollo de las raíces ya que, en este componente de la planta.

Se dan interacciones complejas que ocurren entre los exudados de la raíz derivados de la fotosíntesis y otros procesos fisiológicos de la planta, el suelo y el microbioma, el cual está habitado por una amplia gama de microorganismos que incluyen hongos, bacterias, actinomicetos, algas y nematodos, donde la dominancia está determinada por el producto de los exudados de la raíz (carbohidratos, aminoácidos, ácidos grasos, nucleótidos, ácidos orgánicos, fenólicos, reguladores del crecimiento, putrescencia, esteroles, azúcares y vitaminas, entre otros compuestos), lo que repercute en la dinámica poblacional y funcional de los microorganismos del suelo, el cual difiere de la zona rizosférica al resto de la población presente en el suelo o sustrato (De-Bashan et al., 2007; Rashid et al., 2012; Esquivel-Cote et al., 2013; Hungria et al., 2016; Mora et al., 2017; Singh et al., 2017; Posada et al., 2018; Ramakrishna et al., 2019).

El pasto ovillo (Dactylis glomerata L.) es una especie cultivada y aprovechada por su alto valor nutritivo, rápido rebrote, rendimiento de MS, producción de tallos y por ser una especie asociada a leguminosas que permiten un uso más eficiente de la radiación y del recurso suelo (Castro et al., 2012; Castro et al., 2013; Villareal et al., 2014; Flores-Santiago et al., 2018).

La información publicada sobre el uso de biofertilizantes o bacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPB, por sus siglas en inglés) en esta especie, es nula; sin embargo, estás han sido reportadas en otros pastos del género Penissetum (Criollo et al., 2012), Brachiaria (Lopes et al., 2018), Zea (Tejada et al., 2016), Sorgum y Tritricum (Naiman et al., 2009; Rangel et al., 2014). Reportando diferencias (p< 0.05) por la inoculación o efecto de las bacterias en comparación con el testigo que por lo general se refieren al suelo sin fertilizar.

Montalvo-Aguilar et al. (2018), evaluaron el efecto de la fertilización con digestato a diferentes concentraciones y reportaron que el incremento en el rendimiento fue gradual (p< 0.01) en relación a la concentración, la cual también presenta una interacción con la frecuencia de cosecha del pasto. En este experimento se evaluó el efecto del digestato (esterilizado y no estéril) como medio de inoculación de las bacterias; así como, el efecto de las bacterias en suelo estéril y no estéril es por ello que el objetivo fue evaluar el efecto de bacterias promotoras del crecimiento vegetal en el rendimiento de pasto Ovillo en condiciones de invernadero.

Materiales y métodos

El experimento se llevó a cabo en un invernadero de plástico tipo túnel con ventanas laterales del Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada del Instituto Politécnico Nacional (IPN), ubicado en Tepetitla de Lardizábal, Tlaxcala (19° 16’ 50.3” latitud norte, 98o 21’ 58.1” longitud oeste, 2 221 msnm). La temperatura a la intemperie se muestra en la Figura 1.

Figura 1. Temperatura promedio máxima y mínima ambiental, en Tepetitla de Lardizabál, Tlaxcala. https://www.accuweather.com/es/mx/tepetitla/240244/weather-forecast/240244.

Las semillas de pasto ovillo (Dactylis glomerata L.) fueron donadas por el laboratorio de forrajes del Posgrado en Ganadería del Colegio de Postgraduados. El digestato se obtuvo de la Granja Experimental del Departamento de Zootecnia de la Universidad Autónoma de Chapingo (UACH). La composta hecha de residuos de jardinería fue donada por la unidad de composteo unidad Zacatenco del Instituto Politécnico Nacional. El suelo utilizado como sustrato se obtuvo de la parcela experimental del CIBA IPN Unidad Tlaxcala, el cual se identificó como Fluvisol de textura arenosa.

La siembra de pasto ovillo se realizó colocando 15 semillas en el sustrato que contenía 1.5 kg de suelo en macetas de plástico (unidad experimental). Una vez emergidas las plántulas, se realizó un aclareo manual para dejar sólo 10 tallos por maceta y se dejó un periodo de establecimiento de 45 días después de la siembra, posteriormente se realizó un corte de uniformización a cinco cm de altura, para reducir el efecto de covariable y se inocularon las bacterias plant growth-promoting bacteria (PGPB) directamente a la rizosfera del pasto por medio de jeringas de plástico.

Selección e inoculación de baterías PGPB

Se realizaron diluciones seriadas de las muestras de suelo, composta y digestato. Se cultivó 1 ml en cajas Petri a tres diluciones 10-2, 10-4 y 10-6, con un periodo de incubación de 24 h a 30 oC. Se obtuvieron cultivos puros para describir las características particulares y con los morfotipos seleccionados se inocularon en los medios selectivos y específicos: Paenibacillus, Variovorax, Lysobacter, Azospirillum, Streptomyces, Streptomyces, Pikovskaya, Ashby, NFb y NBRIP (Bashan y Holguin, 1997; Noumavo et al., 2013; Beghalem et al., 2017).

Las bacterias que presentaron crecimiento en estos medios se volvieron a inocular en medios específicos Pikovskaya, Ashby, NFb y NBRIP para evaluar su potencial como solubilizadoras de potasio, fijadoras de nitrógeno y solubilizadoras de fósforo, respectivamente. Las cepas seleccionadas para este experimento se identificaron como Ewingella americana, Pseudomonas clororaphis, Bacillus toyonensis y Microbacterium oxidans, las cuales fueron previamente identificadas mediante secuenciación del ARNr 16S.

La inoculación de las bacterias se realizó directamente en el suelo, en la rizosfera de los macollos al inicio de la temporada, a una concentración de 1 x 108 UFC ml-1, y el medio de inoculación fue el digestato líquido. Se utilizó un diseño completamente al zar con arreglo factorial 5 x 2 x 2, donde los factores fueron: bacterias (cinco cepas de bacterianas), medio de inoculación (digestato estéril y no estéril) y sustrato (suelo estéril y suelo sin esterilizar). Aunado a eso se establecieron unidades experimentales con suelo sin inocular (testigo negativo) y unidades experimentales con fertilización química (triple 17) como testigo positivo. Los valores de proteína se graficaron en SigmaPlot V.10.0 y los análisis de estadísticos se realizaron mediante el procedimiento GLM del Software estadístico SAS® versión 9.0 para Windows®. Las medias de tratamientos fueron comparadas utilizando Tukey a un nivel de significancia de 5%. Los medios y los sustratos fueron esterilizados en una autoclave marca Prado, modelo AH-80170.

Variables evaluadas

El rendimiento de MS se determinó cada cinco semanas (Velasco et al., 2001) a una altura de cosecha de cinco centímetros, colocando todo el forraje cortado en bolsas de papel previamente identificados. El material vegetal cosechado se lavó y se pesó en fresco, para posteriormente secarlo en una estufa de aire forzado a 70 oC, por 48 h hasta un peso constante y se determinó el contenido de materia seca.

Antes de cada defoliación, se registró la altura del forraje con una regla graduada de cincuenta centímetros y una precisión de 0.1 cm, en plantas elegidas al azar, con la regla colocada completamente vertical desde la base de la planta hasta la hoja superior más joven (Castillo et al., 2009; Castro et al., 2011). Asimismo, el contenido de clorofila (unidades SPAD) se midió antes de cada corte, tomando 3 muestras por macollo, colocando el sensor del instrumento Apogee instruments MC-100, en las hojas superiores expuestas con la lígula bien diferenciada.

El contenido de proteína en hojas se obtuvo de una muestra de cada a tratamiento a mediados de cada época evaluada, la cual se molió en un mortero de porcelana y se utilizaron tamices de 0.5 y 0.17 mm, el material obtenido se introdujo en tubos Appendort de 1.5 ml, las cuales fueron analizadas por el equipo Thermo Scientific (Flash 2000 Series, Organic Elemental Analizer).

Resultados y discusión

El rendimiento de forraje de pasto ovillo registró que tanto en primavera como en verano existieron diferencias (p< 0.05) por efectos de las diferentes bacterias, en primavera P. clororaphis fue la que obtuvo el menor registro (2.74 g MS maceta-1) y no fue diferente (p< 0.05) al resto de las bacterias a excepción de E. americana (suelo), qué fue la que registró (p< 0.05) el mayor valor (3.5 g MS maceta), superando en 27% a P. clororaphis (menor registro), en 20% a M. oxidans y B. toyonensis, respectivamente y en 5% a la misma especie, que se obtuvo del digestato. Mientras que, en el verano el comportamiento del rendimiento cambio y la bacteria (E. americana (suelo)) qué obtuvo el mayor rendimiento en primavera, ahora registró (p< 0.05) el menor rendimiento (2.98 g MS maceta-1), pero no fue diferente (p> 0.05) a su misma especie que se obtuvo del digestato, ni a P. clororaphis y M. oxidans, donde estás ultimas fueron similares (p> 0.05) a B. toyonensis que fue la que la que registró (p< 0.05) el valor más alto (3.74 g MS maceta-1), superando en 14 y 18% a M. oxidans y P. clororaphis, respectivamente y en 21 y 25% a E. americana de digestato y composta, respectivamente.

El medio de inoculación (digestato) no registró diferencias (p> 0.05) entre ser esterilizado y no esterilizado, lo que nos infiere que el resultado en el rendimiento es debido a las bacterias y no al medio mientras que, el mismo resultado se obtuvo con el suelo; es decir, el efecto es el mismo si el suelo está estéril o no, al momento de la inoculación. Con respecto al efecto del factor principal solo se registró que la cepa (p< 0.05) tuvo efecto en el rendimiento tanto en primavera como en verano, mientras que el suelo y el digestato no (p> 0.05) y en las interacciones solo en el verano se registró que la cepa*suelo fue la que tuvo efecto en el rendimiento (Cuadro 1).

Las unidades SPAD que están estrechamente relacionadas con el contenido de clorofila y por consecuencia del nitrógeno en la planta,  no registró diferencias en primavera (p> 0.05) entre bacterias; Sin embargo, en el verano a excepción de E. americana (suelo) que registró el menor valor (1.8) (p< 0.05), en el resto de las bacterias no se registraron diferencias (p> 0.05), registrándose que, B toyonensis, E. americana (digestato) y P. clororaphis fueron las mejores (p< 0.05) a pesar de no existir una diferencia entre ellas y superando en un promedio de 70% a la que registró el menor valor. En el análisis de factorial se registró que ni el medio, ni el sustrato presentaron efecto (p> 0.05). Sin embargo, solo existió efecto de la cepa en la época de verano, mientras que el resto de los factores y las interacciones no fueron significativas (Cuadro 1).

Cuadro 1. Rendimiento de materia seca (g MS maceta-1), unidades SPAD y altura del (cm) de pasto Ovillo, inoculado con bacterias PGPB en medios y sustratos esterilizados y no esterilizados.

Diferentes literales mayúsculas en columnas son estadísticamente diferentes Tukey (p< 0.05). Sign= significancia *= 0.05; ns= no significativo.

Con respecto a la altura del forraje, tanto en primavera como en el verano, no se registraron diferencias (p> 0.05). Sin embargo, en la época de verano en el análisis factorial la interacción cepa*suelo, registró un efecto sobre la altura. No obstante, la prueba de medias no registró diferencias, a pesar de que la diferencia en altura entre el valor más alto (B. toyonensis) y el más bajo (M. oxidans y E. americana) fue de 16% (Cuadro 1).

El contenido de proteína registró qué a excepción de P. clororaphis en el resto de los tratamientos en primavera se registró mayor contenido de proteína que en el verano (Figura 2). Asimismo, en la primavera se evidenció que a excepción del control negativo (suelo solo) y P. clororaphis, en el resto de los tratamientos se presentó mayor contenido de nitrógeno en las hojas, siendo E. americana (digestato) la que registró el mayor valor (23%), superando 90% al suelo sin fertilizante y 20% al fertilizante químico. En el verano el comportamiento de la proteína en hojas registró que P. clororaphis fue la superior (15%), superando en promedio con 61% a los tratamientos testigos (Figura 2).

Figura 2. Contenido de proteína en hoja de pasto Ovillo, fertilizado con bacterias PGPB, testigo negativo (suelo) y fertilizante químico en las épocas de primavera y verano de 2018.

Diferentes autores, como Hernández-Garay et al. (1997); Moliterno (2002), Ganderats et al. (2003), Mendoza-Pedroza et al. (2018), Gaytan et al. (2019), mencionan que el rendimiento de forraje está determinado por la interacción de los diferentes factores ambientales en un clima o lugar dado, pero la variable ambiental que más influye en el rendimiento de una especie forrajera es la temperatura ambiental (McKenzie et al., 1999).

No obstante, en este experimento se demuestra que está variable no solo afecta a la planta sino también al suelo y por consecuencia a la microbiota de la rizosfera, la diferencia entre la época de primavera y verano fue de 1.7 oC en la temperatura máxima registrada (Figura 1) y esta diferencia fue suficiente para evidenciar que en primavera Ewingella americana registró el mayor efecto en el rendimiento, mientras que en verano lo registró Bacillus toyonensis (Figura 3).

Figura 3. Rendimiento de materia seca de pasto Ovillo, fertilizado con bacterias PGPB, testigo negativo (suelo) y fertilizante químico en las épocas de primavera y verano de 2018.

Mientras tanto Psedumona. clororaphis, Bacillus toyonensis y los testigos tuvieron más efecto sobre el rendimiento que en primavera, lo que nos permite inferir que, en las diferentes épocas del año, las poblaciones de bacterias de la rizosfera que tienen simbiosis con los pastos difieren dependiendo de la temperatura ambiental. Sin embargo, otras publicaciones solo han evidenciado y sugerido que inocular bacterias PGPB tiene efectos en el rendimiento en gramíneas (Lopes et al., 2016), para la producción de grano (Rangel et al., 2014), en forrajes de clima tropical (Humgria et al., 2016), en leguminosas (Pérez-Montaño et al., 2014) y en pastos clima templado (Criollo et al., 2012), pero en ningún artículo mencionan el efecto de la temperatura o una conclusión con respecto a esta variable.

Las unidades SPAD, es una colorimetríca de las hojas, las cuales están correlacionadas con el contenido de nitrógeno en la planta, y este elemento está a la vez determina el contenido de proteína. En este experimento se registró que en primavera E. americana (suelo), fue la que evidenció el mayor valor de las unidades SPAD y a la vez de proteína, mientras que, en el verano, el menor valor de proteína lo obtuvo M. oxidants (Figura 2) que también registró los valores más bajos de unidades SPAD (Cuadro 1). Rodríguez et al. (1998); Gonzales-Torres et al. (2009), mencionan que los coeficientes de determinación entre las unidades SPAD y el contenido de clorofila en la planta es de 0.79 en promedio. No obstante, estos autores hicieron la determinaron de nitrógeno en toda la planta y la correlacionaron con los valores obtenidos en el medidor de clorofila. Mientras que, en este experimento solo se tomó el registró del medidor portatil en las hojas, que son las que contienen el mayor contenido de proteína en un pasto.

Con respecto al digestato y al suelo, los resultados obtenidos muestran que la condición de la aplicación (estéril o no) no influye en el rendimiento de materia seca del pasto ovillo, a pesar de que el medio no estéril fue 12% superior al esterilizado (digestato) y en el suelo solo se registró una diferencia de 3%. Para el caso del digestato la diferencia en el porcentaje podría deberse a la carga microbiana que tiene efectos beneficios al suelo, mientras qué, el aporte de nutrientes sigue siendo el mismo.

Esta aseveración coincide con lo que menciona Tilvikiené et al. (2018), quienes reportaron los beneficios de los microorganismos y del aporte de materia orgánica al fertilizar con digestato el pasto ovillo por cinco años consecutivos. Montalvo-Aguilar et al. (2018), reportaron que entre mayor sea la concentración del digestato, el rendimiento de forraje tiene una tendencia ascendente en el rendimiento de Lolium perenne; asimismo, Walsh et al. (2012) reportaron que la fertilización con digestato en Ballico perenne, supera (p< 0.05) en el rendimiento a praderas asociadas con trébol blanco (Trifolium repens). Tempere y Viiralt (2014) reportaron que en pastos de clima templado fertilizar con digestato se incrementa el rendimiento en promedio 2.4 t MS ha-1, en comparación con praderas no fertilizadas y es superior en 85% a la fertilización química.

Con respecto a la altura de forraje, se registró qué a excepción del testigo negativo (p< 0.05), en el resto de los tratamientos en primavera se obtuvieron mayores registros (Figura 4), y los tratamientos con bacterias fueron superiores (p< 0.05) a los testigos en esta variable. Algunos autores han evidenciado que los forrajes que presentan las mayores alturas no necesariamente son los más productivos, ya que conforme aumenta la altura de la especie forrajera y se incrementa en rendimiento, en los estratos inferiores, también se va acumulando el material muerto o senescente, lo que sugiere que conforme incrementa la altura de la planta, el rendimiento de forraje es resultado de la biomasa verde o viva y del tejido en descomposición. (Hernández-Garay et al., 1997; Velasco et al., 2003; Montes et al., 2016; Mendoza-Pedroza et al., 2018; Gaytan et al., 2019).

Figura 4. Altura de forraje de pasto Ovillo, fertilizado con bacterias PGPB, testigo negativo (suelo) y fertilizante químico en las épocas de primavera y verano de 2018.

Conclusiones

Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal tienen efecto directo en el rendimiento de forraje del pasto ovillo, y el nivel de influencia está determinado por la temperatura ambiental, por lo que se tendría que evaluar más al respecto, y así podría proponerse un manejo de la inoculación con bacterias PGPB en las diferentes épocas del año. En este experimento todos los tratamientos con bacterias fueron superiores a los testigos, independientemente de que los medios (digestato) y sustratos (suelo) fueran estériles o no.

Agradecimientos

A la MC Stefani Aletse Meza Zamora por la toma de datos y a la MC Laura Jeannette García Barrera, por todo el apoyo en el aislamiento e identificación de las bacterias evaluadas en este trabajo. Al Instituto Politécnico Nacional, Secretaría de Investigación y Posgrado por el financiamiento del proyecto multidisciplinario SIP 20180320.

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