Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas   volumen 11   número 3   01 de abril - 15 de mayo, 2020

DOI: https://doi.org/10.29312/remexca.v11i3.2017

Artículo

Caracterización molecular de bacterias rizosféricas asociadas a Echinocactus platyacanthus en invernadero y silvestres

Leilani Itzel Salinas Virgen1

María Eugenia de la Torre Hernández1§

José Félix Aguirre Garrido2

Hugo César Ramírez Saad1

1Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco. Calzada del Hueso 1100, Ciudad de México, México. CP. 04960. (lisv.nani@gmail.com; hurasa@correo.xoc.uam.mx). 2Universidad Autónoma Metropolitana-Lerma. Av. Hidalgo Pte. 46, Col. Lerma de Villada, Estado de México, México. CP. 52006. (j.aguirre@correo.ler.uam.mx).

§Autor para correspondencia: mdelatorre@correo.xoc.uam.mx.

Resumen

La biznaga dulce (Echinocactus platyacanthus) es una cactácea endémica de México caracterizada por su lento crecimiento y baja tasa de reproducción, lo que aunado a una alta presión de recolecta, coloca a las poblaciones silvestres en una situación de riesgo. Actualmente, el estudio de las comunidades bacterianas asociadas a cactáceas es escaso y se desconoce qué bacterias cultivables están presentes en la rizósfera de las biznagas dulces que crecen en la naturaleza y en las que se cultivan en viveros. Para este estudio se recolectó material rizosférico de biznagas silvestres y cultivadas, además de suelo no rizosférico. Se aislaron en total de 268 morfotipos y se agruparon en 41 ribotipos diferentes por RFLP. Representantes de cada ribotipo se identificaron mediante la secuenciación del gen 16S rRNA. La fracción cultivable de la comunidad bacteriana asociada con E. platyacanthus está compuesta principalmente por miembros de los géneros Bacillus (21 cepas), Pseudomonas (seis cepas), Stenotrophomonas (cuatro cepas), Paenibacillus (dos cepas), Brevibacterium, Staphylococcus y Cutibacterium (una cepa, cada una), siendo Bacillus el género predominante. Los géneros Bacillus y Pseudomonas han sido reportados previamente por llevar a cabo actividades beneficiosas para las plantas a las que están asociados.

Palabras clave: Echinocactus platyacanthus, filogenia, rizósfera.

Recibido: febrero de 2020

Aceptado: abril de 2020

Introducción

Las zonas áridas y semi-áridas constituyen alrededor de 60% del territorio mexicano (CONAZA, 2019). En ellas habita un gran número de especies vegetales pertenecientes a la familia Cactaceae, cuyos miembros conforman varios de los grupos más representativos de la diversidad biológica mexicana, colocando al país como el principal centro de diversidad cactológica en el mundo (Hernández-Oria et al., 2007).

El cuadrante de Tolimán, ubicado en el extremo sur del desierto de Chihuahua, es una de las regiones donde se encuentra ampliamente representada la diversidad de cactus. Ahí es posible encontrar 55 especies de cactáceas, de las cuales 13 son endémicas; sin embargo, 17 de ellas están en alguna categoría de riesgo para su supervivencia (Hernández et al., 2007).

Las cactáceas son ampliamente utilizadas por las comunidades humanas como material de construcción, alimento humano y de ganado, además de darles usos medicinales y ornamentales (Meza-Nivón, 2011). Adicionalmente, el consumo desmedido, la extracción directa de ejemplares de su hábitat, el alto endemismo, la especificidad ambiental de sus poblaciones, el lento crecimiento, la poca resiliencia y los ciclos de vida largos, provocan que muchas cactáceas estén en condición de riesgo de extinción (Álvarez et al., 2004; Arias et al., 2005).

Echinocactus platyacanthus, también conocida como ‘biznaga dulce’, es una cactácea de cuerpo globular, endémica de México que se distribuye en los estados de Coahuila, Guanajuato, Hidalgo, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, Querétaro, San Luis Potosí, Tamaulipas y Zacatecas (González-Medrano, 2012). Actualmente está en condición de riesgo debido a la alta demanda de ejemplares para consumo humano (con ella se elabora el tradicional dulce de acitrón).

Está considerada en el apéndice II de la convención sobre comercio de especies amenazadas de flora y fauna silvestre (CITES), por sus siglas en inglés, por la NOM‐059‐SEMARNAT‐2010 en la categoría ‘sujeta a protección especial’ (Denisse, 2010) y por la lista roja de la unión internacional para la conservación de la naturaleza (UICN), en la categoría ‘casi amenazada’ (Castañeda-Romero et al., 2016).

El estudio de la fracción cultivable de bacterias asociadas a cactáceas es un campo relativamente poco explorado. En la región de Caatinga, Brasil, se aislaron bacterias que pudieran ser tolerantes a la sequía, para ser utilizadas en la recuperación de suelos desérticos (Kavamura et al., 2013), por su parte Chávez-Ambriz et al. (2016), emplearon bacterias aisladas de la rizósfera de Coryphantha radians y Mammillaria magnimamma para promover el crecimiento de Mammilaria zeilmanniana.

Otros estudios utilizaron enfoques metagenómicos para el análisis de las comunidades bacterianas asociadas a la rizósfera de cactáceas endémicas de la Reserva de la Biósfera de Tehuacán-Cuicatlán (Aguirre-Garrido et al., 2012; Torres-Cortés et al., 2012) y recientemente, se analizó el efecto de la contaminación del suelo por Zn, sobre la diversidad de la microbiota asociada a Echinocactus platyacanthus, para explicar su alta tolerancia al estrés ambiental (Sarria-Carabali et al., 2019).

A partir de la rizósfera de plantas de Echinocactus platyacanthus silvestres y cultivadas en invernadero se obtuvo una colección de bacterias, que permitió conocer la composición de la comunidad de bacterias cultivables presente en la rizósfera de la biznaga dulce de la zona del semidesierto queretano. Los aislados fueron caracterizados bajo criterios moleculares, mediante ensayos de restricción enzimática de amplicones del gen 16S rRNA y posteriormente identificados por secuenciación del mismo gen.

Materiales y métodos

Obtención del material biológico

En 2017, se realizó un muestreo no invasivo del material rizosférico de 20 biznagas en una población silvestre de Tolimán, Querétaro. Adicionalmente, se colectaron muestras de la rizósfera de 2 plantas cultivadas en vivero y de suelo no rizosférico (tomadas de suelo silvestre, libre de la presencia de cualquier planta), con la finalidad de tener representada toda la comunidad bacteriana asociada o cercana a la biznaga, la cual se ve influenciada por las variaciones nutricionales de los diferentes tipos de suelo.

Las muestras se guardaron en bolsas herméticas. Se rotularon con el origen de la planta de la que fueron tomadas y se trasladaron en una hielera al laboratorio de Ecología Molecular de la Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco, para su procesamiento tres días después de su recolección.

Cuentas viables y aislamiento

Las muestras de un mismo origen (silvestres, vivero o suelo no rizosférico) se mezclaron y se realizaron suspensiones con un factor de dilución 1:10 con 1 gramo de suelo y 9 mL de solución salina (NaCl 0.9%). A partir de las suspensiones se hicieron diluciones seriadas para realizar el conteo de UFC por el método de extensión en placa (Bonilla et al., 2016).

En medio de cultivo para heterótrofos TY (triptona 5 g L-1, extracto de levadura 3 g L-1, CaCl2        1 g L-1, pH7, agar 1.2%). Una vez realizadas las cuentas viables, de las mismas cajas se aislaron bacterias con morfotipos coloniales diferentes. La morfología microscópica de cada aislado se determinó por la tinción de Gram (Gram, 1884).

Obtención del material genético

El DNA genómico de todos los aislados se obtuvo con el kit de extracción High Pure PCR Template Preparation Kit de Roche (Cat. # 11 796 828 001), siguiendo las indicaciones del fabricante. El gen 16S ribosomal se amplificó por PCR con los primers 8F y 1492R.

El producto obtenido se purificó con el kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up Systema de Promega (Cat. A9281), siguiendo las instrucciones del fabricante. Tanto la integridad del DNA genómico, como el tamaño de los productos de PCR se evaluaron por electroforesis en geles de agarosa al 1%, teñidos con bromuro de etidio (0.5 µg mL-1), conforme a un reporte previo (Aguirre-Garrido et al., 2012).

Agrupamiento por RFLP

Para el análisis de los fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLP) por sus siglas en inglés, se utilizaron las enzimas de restricción de corte frecuente HaeIII (GG/CC) y MspI (C/CGG), bajo las condiciones descritas por Massol-Deya et al. (1995). Las reacciones de restricción se analizaron en geles de agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio (0.5 µg mL-1). A partir, de los patrones de restricción obtenidos se hizo el agrupamiento de la colección de bacterias rizosféricas.

Análisis filogenético

Representantes de cada uno de los patrones de restricción (ribotipos) obtenidos fueron sometidos a análisis filogenético. Bajo las mismas condiciones de amplificación y purificación descritas arriba, se obtuvieron los amplicones para ser sometidos a secuenciación tipo Sanger, en la empresa Macrogen (Corea).

A partir de estas secuencias se realizaron análisis bioinformáticos con los softwares y plataformas: BioEdit (Hall, 1999); ClustalX (Thompson et al., 1997); SeaView (Galtier et al., 1996; Gouy et al., 2010); JModelTest (Darriba et al., 2012); Mega6 (Tamura et al., 2013); Bellerophon (Huber et al., 2004); EZTaxon (Yoon et al., 2017), para la identificación taxonómica de las bacterias y el establecimiento de sus relaciones filogenéticas (Aguirre-Garrido et al., 2012).

Resultados y discusión

Cuentas viables y aislamiento bacterian

Las cuentas viables de la rizósfera tanto de plantas silvestres, como de vivero y de suelo no rizosférico se muestran en el Cuadro 1. Las muestras de E. platyacanthus silvestres y las de suelo no rizosférico dieron valores de UFC muy altos, que se encuentran por encima de los conteos previamente reportados.

Cuadro 1. Conteo de UFC de bacterias aisladas a partir de las diferentes muestras.

Para muestras de rizósfera de otras cactáceas (Aguirre-Garrido et al., 2012). En adición, los valores de estos dos grupos de muestras son cuatro órdenes de magnitud más altos que las muestras de vivero. Sin embargo, el análisis de varianza y la prueba de Tukey (p≤ 0.05) correspondiente, indicaron que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los tres tipos de muestras.

Se aislaron en total 268 cepas bacterianas: 261 de material rizosférico y 7 de suelo no rizosférico. De la colección total, 201 cepas fueron agrupadas en 41 ribotipos obtenidos por RFLP, los que fueron nombrados P1 a P41 (Cuadro 2). Las 67 cepas restantes no rindieron patrones de restricción fiables que permitieran ubicarlas en alguno de los ribotipos obtenidos y fueron excluidas del análisis.

Cuadro 2. Número total de aislados de la rizósfera de E. platyacanthus y su agrupamiento por RFLP.

C= cultivadas; S= silvestres; nr= no rizosféricas.

Las cepas agrupadas en los ribotipos P1, P16, P17, P18, P19, P25, P30, P31, P32, P33, P34, P35, P36, P37, P38, P39, P40 y P41 son exclusivas de las muestras silvestres. Mientras que las cepas de los ribotipos P3, P4, P6, P10, P11, P15, P20, P21, P23, P27, P28 y P29 se aislaron de las muestras de vivero.

Las cepas agrupadas en el resto del ribo tipos (P2, P5, P7, P8, P9, P12, P13, P14, P22, P24 y P26) se encontraron en ambos tipos de muestras. En el caso de los patrones P2 y P26 el mayor número de aislados provienen de las muestras silvestres. Los aislados de las muestras de suelo no rizosférico se agruparon en el ribo tipos P18, P26 y P30, mismos que comparte con las muestras silvestres.

Identificación y análisis filogenético

Para establecer la identidad y las relaciones filogenéticas de la colección, se seleccionó un representante de cada ribo tipo, excepto para el caso de los ribotipos P1, P2, P18 y P26 que tienen mayor número de aislados. En estos casos se seleccionaron dos cepas con el fin de corroborar el agrupamiento por RFLP.

Las dos secuencias del gen 16SrRNA obtenidas para cada aislado fueron ensambladas y se obtuvieron secuencias casi completas de dicho gen (>1350 nr). Las secuencias ensambladas fueron analizadas en Bellerophone (Huber et al., 2004) para descartar la formación de quimeras. Posteriormente, se trabajaron en la plataforma EZTaxon (Chun et al., 2007), que permite realizar una identificación taxonómica precisa ya que posee un algoritmo de comparación robusto y sólo incluye secuencias del gen 16S rRNA pertenecientes a cepas tipo.

Las secuencias P10, P17, P19, P20, P21, P24, P27, P30 y P33 resultaron con porcentajes de cobertura (exhaustividad) menores al 95% y fueron excluidas del análisis filogenético por ser consideradas de baja calidad (Kim et al., 2012). De las 32 secuencias restantes, 10 fueron identificadas a nivel taxonómico de género, con un porcentaje de similitud mayor al 95% (Bou et al., 2011) y 22 a nivel de especie, con un porcentaje de similitud mayor a 98.7% (Kim et al., 2014), como se muestra en el Cuadro 3.

Cuadro 3. Identificación bacteriana de acuerdo con la base de datos de EZTaxon.

En los cuatro casos en los que se seleccionaron dos cepas por ribotipo, ambos aislados de cada patrón produjeron resultados similares. Las relaciones filogenéticas de los representantes de nuestra colección y las cepas tipo de cada género o especie asignados se muestran en la Figura 1.

Construido con el método de máxima verosimilitud (-ln= 15,318.8991), utilizando el modelo sustitución nucleotídica de Jukes-Cantor (Ts/Tv= 0.5). Se utilizó la secuencia del gen 16S rRNA de Thermoplasma acidophilum como outgroup. El análisis de Bootstrap se hizo con 1 000 réplicas aleatorizadas y se muestran sólo los valores ≥50%. La barra de escala indica 5% de divergencia estimada entre las secuencias.

Las cepas aisladas se asignaron principalmente a los géneros Bacillus (21 cepas) y Pseudomonas (6 cepas), aunque también se encontraron otros géneros como Paenibacillus, Brevibacterium, Staphylococcus, Cutibacterium y Stenotrophomonas, de forma menos abundante. Esto concuerda con hallazgos previos, en donde se reportó que Bacillus y Pseudomonas son los géneros predominantes en la rizósfera de las cactáceas Pachycereus pringlei, Stenocereus thurberi, Mammillaria fraileana y Opuntia cholla (Bashan y de-Bashan, 2010).

Figura 1. Árbol filogenético de la comunidad bacteriana cultivable asociada con Echinocactus platyacanthus.

Además, se han aislado representantes del género Bacillus de las rizósferas de Mammilaria spp. y Coryphanta radians, nativas del semidesierto de Querétaro (Chávez-Ambríz, 2016). También se han encontrado estos géneros bacterianos asociados a las rizósferas de Mammillaria carnea, Opuntia pilifera y Stenocereus stellatus, tres cactáceas nativas del Valle de Tehuacán-Cuicatlán (Aguirre et al., 2012).

En un trabajo reciente, Sarria-Carabali et al. (2019), donde también utilizaron como modelo la rizósfera de E. platyacanthus cultivadas, reportaron una abundancia de secuencias relacionadas al género Bacillus, en respuesta a suelos contaminados con diferentes dosis de zinc.

Conclusiones

La comunidad de bacterias rizosféricas cultivables asociada a E. platyacanthus silvestres es más diversa que la de plantas cultivadas, al presentar mayor número de ribotipos (géneros o especies), aunque la estructura de la comunidad es menos homogénea ya que sólo dos patrones; P1 y P2 (Pseudomonas koorensis y Bacillus subtilis, respectivamente) poseen 54.6% de los aislados. Mientras que la comunidad de bacterias cultivables asociada a las plantas cultivadas posee solo 23 géneros, pero las abundancias relativas de cada uno son más homogéneas, variando entre 2.3 y 13.6%.

De las bacterias representantes de los 41 ribotipos obtenidos por RFLP fue posible identificar taxonómicamente 32 cepas, 13 fueron identificadas a nivel de género y el 19 a nivel de especie. La fracción cultivable de la comunidad bacteriana asociada a la biznaga dulce está conformada principalmente por miembros de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Paenibacillus, Brevibacterium, Staphylococcus, Cutibacterium y Stenotrophomonas. El género predominante en la rizósfera de E. platyacanthus es Bacillus, ya que 19 de las cepas caracterizadas por técnicas moleculares pertenecen a este género.

Perspectivas

Existen reportes de bacterias pertenecientes a los géneros encontrados, principalmente Bacillus (Zhao et al., 2015; Gao et al., 2016; Pin et al., 2016; Liu et al., 2017; Zhang et al., 2017) y Pseudomonas (Reetha et al., 2014; Kamble y Galerao, 2015; Abed et al., 2016; Buono y Ulla, 2016; Li et al., 2017), que demuestran que son capaces de establecer relaciones benéficas para las plantas, ya que están clasificadas dentro del grupo de las Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR).

Por esta razón se debe continuar con estudios de caracterización microbiológica de la colección de bacterias asociadas a la biznaga dulce, enfocándose en aquéllos aislados que puedan presentar uno o más mecanismos de promoción del crecimiento vegetal.

Literatura citada

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