Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas   volumen 10  número 4   16 de mayo - 29 de junio, 2019

DOI: https://doi.org/10.29312/remexca.v10i4.1739

Nota de investigación

Control orgánico in vitro de Phytophthora cinnamomi con aceites
esenciales de orégano y clavo

Yisa María Ochoa Fuentes1

Anselmo Hernández Pérez1

Juan Carlos Delgado Ortiz2

Omegar Hernández Bautista2

Ernesto Cerna Chavez1

Luis Alberto Aguirre Uribe1

Luis Mario Tapia Vargas3§

1Departamento de Parasitología-Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Buenavista, Saltillo, Coahuila, México. CP. 25315. (yisa8a@yahoo.com; jabaly1@yahoo.com; luisaguirreu@yahoo.com.mx). 2CONACYT-UAAAN Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro-Departamento de Parasitología, Buenavista, Saltillo, Coahuila, México. CP. 25315. (hernandez.anselmo1@gmail.com; moe-788@hotmail.com). 3Campo Experimental Uruapan- INIFAP. Avenida Latinoamericana No. 1101, Colonia Revolución, Uruapan, Michoacán, México. CP. 60500.

§Autor para correspondencia: mariotv60@hotmail.com.

Resumen

Michoacán es el principal estado productor de aguacate en el mundo; sin embargo, las enfermedades radiculares diezman y dañan los árboles ocasionando su muerte. El objetivo de la presente investigación fue evaluar el control orgánico del crecimiento in vitro de Phytophthora cinnamomi con aceites esenciales de orégano (Lippia berlandieri) y clavo (Syzygium aromaticum). En los meses de octubre y noviembre de 2016, se recolectaron muestras de raíces en árboles con síntomas de la enfermedad en aguacate (Persea americana Mill. var. Hass), en la huerta experimental del INIFAP ubicada en San Juan Nuevo Parangaricutiro, Michoacán. Los aislados se identificaron morfológica y molecularmente. Se evaluó el control de P. cinnamomi con aceites esenciales de orégano y clavo determinando la concentración media inhibitoria y sus límites fiduciales al 95% mediante una regresión Probit por el método de máximas verosimilitud. Los análisis se realizaron utilizando el programa estadístico R 3.4. De acuerdo con los resultados obtenidos, en relación con la inhibición del crecimiento hay una reducción en el crecimiento de P. cinnamomi. Los aceites esenciales de clavo (Syzygium aromaticum) y orégano (Lippia berlandieri) son una alternativa natural para el control del oomiceto P. cinnamomi por su actividad fungicida a bajas concentraciones y pueden incluirse en programas de manejo integrado de enfermedades.

Palabras clave: Persea americana Mill. var. Hass., aceite esencial, inhibición, tasa de crecimiento.

Recibido: marzo de 2019

Aceptado: junio de 2019

El aguacate (Persea americana Mill.) es el fruto de un árbol originario de México y Centroamérica (Téliz, 2000). La producción mundial del cultivo es de alrededor de 4 700 000 toneladas y 70.3% de esta producción lo aporta el continente americano (FAOSTAT, 2015). La República Mexicana es la más importante productora y exportadora de aguacate en el mundo, con una producción de casi 2 millones de toneladas, de las cuales el estado de Michoacán aporta 77% de la producción nacional, convirtiéndolo en la capital mundial de este cultivo (SIAP 2017).

Sin embargo, existen diferentes limitantes fitosanitarias, las cuales, reducen significativamente el rendimiento, ocasionando malformaciones del fruto, causan pérdidas considerables en postcosecha e incluso la muerte del árbol. Se tiene conocimiento de diferentes patógenos causantes de las enfermedades fungosas conocidas como roña (Sphaceloma perseae), antracnosis (Colletotrichum gloeosporioides) y el oomiceto cosmopolita Phytophthora cinnamomi, causante de la pudrición del sistema radicular y en la parte aérea del árbol una marchitez conocida como tristeza del aguacatero, P. cinnamomi es considerado de gran importancia económica (Zentmyer et al., 1994; Pérez, 2008).

Este patógeno, ataca a todas las variedades de aguacate en el mundo, dañando las raíces por efecto de un taponamiento de los haces vasculares, traduciéndose en la muerte del árbol (Coffey, 1992; Whiley et al., 2007). En México, se ha detectado la presencia de la enfermedad conocida como tristeza del aguacatero en todas las zonas productoras; destacando por la severidad de los daños, como por ejemplo en la región de Atlixco, Puebla, donde ocasionó la casi desaparición de este cultivo Reyna (1983). En la región productora de Michoacán, se considera que alrededor de 4 000 ha están afectadas por la enfermedad, presentando una tendencia exponencial (Téliz, 2000).

En este sentido, es necesario tener amplio conocimiento del comportamiento in vitro de P. cinnamomi así como de alternativas orgánicas para su control. Por consiguiente, se requiere partir de medios de cultivos alternativos para acelerar su desarrollo y por ende poder efectuar evaluaciones rápidas en cuanto a su crecimiento, ya que este fitopatógeno es afectado en su desarrollo in vitro por diferentes factores como la temperatura. El control de las enfermedades fúngicas, ha dependido en gran medida de los tratamientos con agroquímicos; sin embargo, su uso representa un severo riesgo para la salud humana y contribuye al aumento de la contaminación al medio ambiente (Abdel-Monahim et al., 2011).

Para reducir este problema, existe la necesidad de investigar, generar, validar, transferir y adoptar estrategias que sean accesibles, sencillas de aplicar y no tóxicas para seres humanos y animales (Naeini et al., 2010). En la actualidad, los productos naturales gozan de amplia aceptación y reemplazan cada vez más a los productos de síntesis química.

Como respuesta a esta tendencia, se ha producido un creciente interés en la investigación de la posible utilización de aceites esenciales y extractos de plantas como fungicidas naturales, que no sean perjudiciales para el medio ambiente (Benites et al., 2009; Bajpai y Kang, 2010). Se ha demostrado que los aceites esenciales y sus compuestos tienen un efecto fungicida (Wilson et al., 1997; Gogoi et al., 1997), por lo cual, ha incrementado el interés por la aplicación de este tipo de productos como agentes antimicrobianos naturales en alimentos y cultivos agrícolas (Celis et al., 2012). Por ende, la agricultura del nuevo milenio debe establecer nuevas alternativas de control que produzcan un menor impacto ambiental, ya que día con día va en aumento el porcentaje de consumidores que demandan alimentos inocuos y libres de residuos de productos químicos, seguros para la salud humana (Ponce et al., 2004).

Por tanto, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la dinámica del crecimiento in vitro de P. cinnamomi en medios de cultivo alternativos y su control con aceites esenciales de orégano (Lippia berlandieri) y clavo (Syzygium aromaticum).

Muestreo: en los meses de octubre y noviembre de 2016, se recolectaron muestras de raíces en árboles de aguacate (Persea americana Mill. var. Hass) bajo presión de inóculo que presentaban sintomatología característica de muerte descendente conocida como tristeza del aguacate. El sitio de recolección fue la huerta experimental del INIFAP ubicada en San Juan Nuevo Parangaricutiro, Michoacán, cuyas condiciones climáticas semicálidas, subhúmedas con lluvias en verano, oscilan entre los 1200 a 1600 mm de precipitación y temperaturas de 10 a 28 °C (García, 1981).

Se realizó un muestreo dirigido cercano al área de goteo a una profundidad de 30 cm en cuatro puntos equidistantes. Con ayuda de una pala recta se tomaron las muestras de raíz (2 a 6 mm de diámetro), con presencia de daño (tejido necrosado color café obscuro) y se colocaron en bolsas de polietileno previamente rotuladas con los datos de la huerta, municipio y georreferenciación, posteriormente se transportaron al laboratorio de fitopatología del departamento de Parasitología Agrícola en la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN).

Aislamientos de los fitopatógenos: se lavaron las raíces con agua destilada estéril para fragmentarlas en trozos no mayores a 0.5 cm, con un bisturí estéril se realizó un corte longitudinal seleccionando los límites de tejido sano y enfermo, los cortes de raíz se lavaron en solución de hipoclorito de sodio al 1% durante 3 min, seguido de tres lavados con agua destilada estéril y se colocaron en papel absorbente previamente esterilizado. Posteriormente, se sembraron en medio selectivo V8® -PARPH colocando cuatro trozos de raíces en forma horizontal en cajas Petri de 8.5 cm de diámetro; tres cajas por muestra, dando un total de 12 raíces por árbol muestreado y finalmente los aislados se incubaron a 28 °C por tres días en obscuridad total (Fierro, 2011).

Purificación y multiplicación: Se transfirieron a medio de cultivo V8® -Agar (Erwin y Ribeiro, 1996), cepas con crecimiento característico de P. cinnamomi. La técnica de purificación utilizada fue por punta de hifa por triplicado, colocadas el centro de la caja Petri, fueron selladas con filme plástico sellador (cling wrap) y se incubaron a 28 °C en cámara bioclimática durante 72 h en el laboratorio de Fitopatología del Departamento de Parasitología Agrícola.

Identificación morfológica y molecular: la esporulación del patógeno se indujo con tiempo de incubación de 7 días  y temperatura controlada de 28 °C ± 2, se identificaron morfológicamente considerando micelio cenocítico, hialino, con presencia de oogonio y crecimiento coraloide, coincidiendo con lo reportado por Erwin y Ribeiro (1996) y molecularmente mediante la técnica PCR-ITS, extrayendo ADN de acuerdo con la metodología de Doyle y Doyle (1990), a partir de 0.2 g de micelio del cultivo puro con buffer de lisis (EDTA 50 mM, pH 8.5; Tris HCl 100 mM, pH 8; NaCl 50 mM; SDS 2%).

La visualización del ADN se realizó en gel de agarosa al 2% teñido con GelRed (GenScript®). La amplificación de la región ITS se llevó a cabo con los iniciadores ITS1 (5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). De igual manera se visualizó el producto de la reacción por medio de electroforesis en gel de agarosa al 2% teñido con GelRed (GenScript®) y el producto del PCR se mandó secuenciar al laboratorio de diagnóstico fitosanitario UA-LAB.

Bioensayos: los aceites esenciales (AE) se obtuvieron de hojas de orégano (Lippia berlandieri) (T1) y botones florales de clavo (Syzygium aromaticum) (T2), mediante a la técnica de arrastre de vapor (Ortuño, 2006). Se determinó la efectividad biológica de los AE sobre P. cinnamomi con la metodología del medio de cultivo V8®-Agar envenenado con diferentes concentraciones 5, 45, 80, 200, 400 y 800 ppm con cuatro repeticiones cada una y un testigo absoluto, se agregó alcohol, tween 80 y goma xantana como agentes emulsificantes.

La siembra se realizó transcurridas las 24 h colocando explantes de 5 mm de diámetro en el centro de las cajas Petri y se incubaron en oscuridad total a 28 ±2 ºC. Para registrar el crecimiento micelial, se midió el crecimiento radial cada 24 h en los cuatro puntos cardinales de las cajas y finalizó cuando los testigos absolutos (TA) del fitopatógeno llenaron la caja Petri. Se calculó el porcentaje de inhibición en P. cinnamomi empleando la fórmula utilizada por Ochoa et al. (2012) la cual consiste en determinar el porcentaje mediante la razón de la diferencia de los tratamientos y el testigo, respecto al crecimiento del testigo.

Análisis estadístico: en los bioensayos, se determinó la concentración media inhibitoria y sus límites fiduciales al 95% mediante una regresión Probit por el método de máximas verosimilitud. Los análisis se realizaron utilizando el programa estadístico R 3.4.

Derivado del aislamiento e identificación morfológica y molecular de los fitopatógenos obtenidos de los muestreos realizados en la huerta experimental bajo presión de inóculo, se lograron obtener diferentes cepas de la misma especie coincidiendo con las claves de identificación de Erwin y Ribeiro (1996) para P. cinnamomi, confirmando la identificación mediante comparar los productos de la secuenciación con los registros de la base de datos del GenBank (Cuadro 1).

Cuadro 1. Caracterización molecular de los aislamientos de las secuencias reportadas en el banco de genes con las secuencias intergénicas (ITS) de los genes rDNA.

1= nomenclatura para los diferentes aislamientos; 2= número de acceso en la base de datos del NCBI (National Center of Biotechnology Information); 3= índice de similitud entre las secuencias de las especies aisladas y las especies comparadas; 4= origen geográfico de los aislados.

Referente a la inhibición obtenida con los aceites esenciales, las regresiones son altamente significativas en los tratamientos evaluados (α= 0.05) a que a mayor concentración se observó una reducción en el crecimiento de P. cinnamomi (Figura 1). La concentración media inhibitoria estimada para el aceite esencial de orégano fue 59.36 ppm, obteniendo una inhibición de 100% contra el crecimiento micelial del Oomiceto a una concentración de 800 ppm.

Figura 1. Inhibición de P. cinnamomi con aceite esencial de orégano y clavo a diferentes concentraciones.

En P. infestans, fitopatógeno perteneciente al mismo género, Soylu et al. (2006) Reportó inhibición total con aceite esencial de orégano a una dosis de 0.3 μg ml-1, investigaciones similares refieren el uso de este aceite para el control del Deuteromicetos, Cueto et al. (2010) presenta resultados de la acción fungicida del aceite y extracto etanólico de orégano sobre Fusarium oxysporum, sin embargo la acción antifúngica  pueden variar según la biología del patógeno: por ejemplo, García et al. (2006) reportó una inhibición de 100% a una concentración de 100 ppm en Aspergillus flavus, cuyo valor de CI50 es más bajo respecto  a nuestra investigación. Por otra parte, Carrillo et al. (2010) atribuye su efecto fungicida asociándolo con el contenido de timol y carvacrol.

Estos compuestos de unidades terpénicas presentes en los aceites esenciales de algunas especies de la familia Lamiaceae, actúan causando alteraciones en la morfología y agregados hifales, provocando una reducción del crecimiento mediante la lisis entre la pared y la membrana celular del agente patógeno (Kordal et al., 2008).

El carvacrol aumenta la fluidez de la membrana causando fuga de protones e iones de potasio, lo que resulta en un colapso del potencial de membrana y la inhibición de la síntesis del ATP (Fisher y Phillips, 2008). Respecto al aceite esencial AE clavo (T2), presentó una CI50 más alto que AE orégano siendo 1.824x mayor (Cuadro 2); sin embargo, al observar su CI95, este valor es menor respecto a T1 (AE orégano), considerando la Figura 1, esto se debe a la homogeneidad de la susceptibilidad del patógeno al aceite esencial (T2), la cual se encuentra con menor cantidad de aceite, diferente de T1, el cual requiere mayor concentración para incrementar la inhibición, actualmente, este aceite esencial es utilizado en la agricultura para contrarrestar otros fitopatógenos como Phytophthora nicotianae (Browers y Locke, 2004). S. aromaticum obtenidos por destilación tradicional y asistido por microondas, es eficiente para inhibir el desarrollo de Alternaria solani y Colletotrichum gloesporioides en 30 y 10% aislados de tomate y papaya, respectivamente (Ramírez et al., 2016). Por otra parte, Damián et al. (2010) reportaron que el extracto de Artemisa sp., inhibe 100% del crecimiento micelial de Phytophthora cactorum, P. capsici, P. cinnamomi y P. mirabilis, así como 60% de P. infestans, a una dosis 100 ppm, esta información difiere a los resultados del presente estudio se necesitan mayores concentraciones para el control de P. cinnamomi.

Cuadro 2. Concentración media inhibitoria de los aceites esenciales sobre P. cinnamomi.

N= número de repeticiones; gl= grados de libertad; CI= concentración inhibitoria, LFI y LFS limite fiducial superior e inferior al 95%; Ec. pred.= ecuación de predicción, P valor, valor de probabilidad (α= 0.05).

Raina (2001) por cromatografía de gases evaluó la composición del aceite de clavo, señalando que el alilbenceno eugenol es el principal compuesto con 94%, cuyo modo de acción propicia la disrupción de la actividad citoplasmática de la membrana aumentando su permeabilidad no específica, además   sugiere que eugenol posee actividad inhibidora de la ATPasa (Gutiérrez et al., 2017). Ambos tratamientos son agentes potenciales de control que pueden ser incluidos en programas de manejo de la tristeza del aguacatero causada por P. cinnamomi, los compuestos y metabolitos secundarios de las diferentes especies botánicas juegan un papel importante en su resistencia contra plagas, por lo cual, las investigaciones sobre las propiedades antimicrobianas de los aceites esenciales permiten descubrir nuevos agentes para el control de fitopatógenos de forma orgánica (Kordali et al., 2007; Lee, 2007).

Conclusiones

De acuerdo con los resultados obtenidos, el medio de cultivo Centeno-agar fue el más eficiente para el aislamiento y proliferación de Phytophthora cinnamomi obteniendo un mayor crecimiento de estructuras morfológicas. Los aceites esenciales de clavo (Syzygium aromaticum) y orégano (Lippia berlandieri) son una alternativa botánica para el control del oomiceto P. cinnamomi por su actividad fungicida por lo que pueden incluirse en programas de manejo integrado de enfermedades, a un costo más bajo que agroquímicos convencionales.

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